NMR-spektroskopische Untersuchungen zu Protein-Ligand-Wechselwirkungen

In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR­ spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildung
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR­ spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildungsrate von N­Carboxymethanofuran (Carbamat) aus CO 2 und Methanofuran im Gleichgewicht und die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch Formylmethanofuran­Dehydrogenase aus Methanosarcina barkeri wurden über 2D­ Protonenaustausch­Spektroskopie (EXSY) bestimmt. Mit Hilfe der berechneten Geschwindigkeitskonstanten und der bekannten physiologischen Konzentrationen von CO 2 und Methanofuran konnte erstmals gezeigt werden, daß die spontane Carbamatbildungsrate ausreicht, um die in vivo­CO 2 ­Reduktionsraten in methanogenen Archaea erklären zu können. (2) Die Konformation von N 5 ,N 10 ­Methylentetrahydromethanopterin (Methylen­ H 4 MPT) in Anwesenheit und in Abwesenheit H 2 ­bildender Methylen­H 4 MPT­Dehydrogenase aus Methanothermobacter marburgensis wurde über Transfer­NOE­Messungen bestimmt. Es wurde nachgewiesen, daß die Bindung zu einer Konformationsänderung des Substrats führt, welche die Re­Seiten­Stereospezifität des Enzyms erklären kann. (3) Die Stereospezifität des Hydridtransfers von Methylen­H 4 MPT auf NADP , katalysiert von NADP­abhängiger Methylen­H 4 MPT­Dehydrogenase aus Methylobacterium extorquens AM1, wurde NMR­spektroskopisch untersucht. In Übereinstimmung mit der unter (2) entwickelten Theorie zum Übergangszustand des Hydridtranfers wurde gefunden, daß auch der Transfer auf NADP Re­Seiten­spezifisch in Bezug auf Methylen­H 4 MPT verläuft. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das Enzym das Hydrid auf die Re­Seite von NADPH überträgt. (4) Die spontane Rate der Kondensationsreaktion von Glutathion und Formaldehyd zu S­Hydroxymethylglutathion wurde mit EXSY­Messungen bestimmt. In Zellextrakten des methylotrophen Proteobakteriums Paracoccus denitrificans wurde eine Enzymaktivität nachgewiesen, die diese Reaktion beschleunigt. Bislang wurde vermutet, daß es eine solche Enzymaktivität nicht gibt. Mit EXSY­Messungen konnte nicht nur diese Enzymaktivität nachgewiesen werden, sondern es gelang auch das verantwortliche Enzym, das Glutathion­ abhängiges Formaldehyd­aktivierendes­Enzym (Gfa) genannt wurde, erstmals zu reinigen und das kodierende Gen zu identifizieren. (5) Die Anzahl der Ubichinon­Bindungsstellen des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Bos bovis wurde bestimmt. Dafür wurde eine NMR­Methode entwickelt, die es ermöglicht, Bindungsstudien von wasserunlöslichen Cofaktoren an membranständigen Proteinen durchzuführen. Über die Aufnahme und Integration von 1 H, 13 C­HSQC­Spektren unter Verwendung von HR­MAS­NMR konnte die Konzentration des Ubichinons, das in der Proteoliposomenmembran frei beweglich ist, quantifiziert werden. Verdrängungsstudien mit spezifischen Inhibitoren ermöglichten es dann, durch den Vergleich der freigesetzten Ubichinonkonzentrationen relativ zu der Cytochrom bc 1 Komplexkonzentration nachzuweisen, daß insgesamt drei Ubichinone spezifisch an den Cytochrom bc 1 Komplex binden. Die Ergebnisse werden in 5 Abschnitten beschrieben. Im Anhang zu jedem Abschnitt finden sich die Abdrucke der bereits erschienenen Veröffentlichungen (Abschnitte 1 bis 3) und ein zur Veröffentlichung akzeptiertes Manuskript (Abschnitt 5). In der Einleitung werden die Möglichkeiten aufgezeigt, mit modernen NMR­spektroskopischen Methoden Protein­ Ligand­Wechselwirkung zu studieren. In der Diskussion werden anhand der Ergebnisse die Limitierung, aber auch das noch nicht ausgeschöpfte Potential dieser Methoden erläutert. Während der Doktorarbeit wurden auch Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften einer energiekonservierenden Hydrogenase aus M. barkeri durchgeführt. Die daraus entstandene Publikation ist im Anhang zu finden.
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Metadaten
Author:Stefan Bartoschek
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000000251
Referee:Christian Griesinger
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2003/05/05
Year of first Publication:2001
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2001/10/15
Release Date:2003/05/05
SWD-Keyword:Proteine ; Ligand <Biochemie> ; Wechselwirkung ; NMR-Spektroskopie
HeBIS PPN:101448198
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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