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Peter Gröschke

• Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von kleinen, nicht­ isotopenmarkierten Proteinen mit Hilfe der NMR­-Spektroskopie. Ziel ist die Aufklärung der Struktur und der biologisch relevanten Wechselwirkung mit anderen Molekülen. Konkret wird die strukturelle Aufklärung der zweiten Kunitz­Domäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI), TFPI­2 beschrieben. Dieses Molekül spielt eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung (Kapitel 2.2) in Säugetieren, in dem es bei kleinsten Verletzungen die Gerinnung unterbindet und so die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen des betroffenen Bezirks aufrecht erhält (Kapitel 2.3). Die untersuchte zweite Domäne des TFPI lagert sich direkt und spezifisch an ein zentrales Molekül der Gerinnungskaskade, den Faktor Xa, an. Neben dieser bio­ logischen Funktion trägt die Entdeckung des TFPI dazu bei, die strikte Trennung der Gerinnung in zwei voneinander unabhängige Reaktionswege bis zur Bildung des Fibrinpolymers aufzuheben. Zur Bestimmung der Struktur des unmarkierten Proteins wurden NMR­Spektren aufgenommen. Neben den im Kapitel 3 beschriebenen Standardexperimenten wur­ den im Rahmen der Untersuchungen das TACSY­Experiment in neuer Art und Weise genutzt (Kapitel 4.2), da die Probe ein ungünstige Relaxationseigenschaften auf­ wies. Mit dem entwickelten Experimenten ist ein neuer Ansatz zur Bestimmung von Kopplungskonstanten in nicht­markierten Molekülen nun auch in solchen Proben möglich, da die Güte der abgelesenen Konstanten nicht mehr von der Signalbreite beeinflußt wird. Ausgehend von diesen Untersuchungen wurde ein neues Experiment zur Bestim­ mung von 3 J(HN­H)­Kopplungskonstanten entwickelt. Das SIAM­TACSY (Kapitel 4.3), ermöglicht die Bestimmung der Kopplungskonstanten nach der DISCO­Me­ thode, für die bislang die Aufnahme von wenigstens zwei Spektren mit unter­ schiedlichen Methoden nötig war, mit nur einem einzigen Spektrum. Beide Methoden, SIAM--TACSY als auch die in dieser Arbeit näher beschriebene Me­ thode, umgehen die Notwendigkeit der Aufnahme verschiedener Spektren mit un­ terschiedlichen Pulssequenzen und Aufnahmebedingungen. Während SIAM--TACSY mit nur einem Experiment auskommt, dessen Daten durch unterschiedliches Post-Processing alle Kopplungskonstanten liefern, müssen mit der in Kapitel 4.2.2 be­ schriebenen Methode mehrere Spektren desselben Typs aufgenommen werden. Im Verlauf der Arbeit wurden die Resonanzen von 52 von 58 Aminosäuren eindeu­ tig und vollständig zugeordnet (Kapitel 3.4). Die Spektren liefern die für die Struk­ turrechnungen notwendigen Parameter (Kapitel 5). Die berechnete Struktur basiert auf 762 Distanz­Restraints, 20 Dihedral­Winkel des Protein­Rückgrats und 15 Wasserstoffbrückenbindungen. Diese Parameter wurden zunächst in Distance­-Geometry-­Berechnungen (Kapitel 6.2) eingesetzt. Zur Verfeinerung der Struktur wurde in den späteren Rechnungen das Simulated­Annealing­Verfahren (Kapitel 6.1) genutzt. In einem iterativen Ver­ fahren werden die gewonnenen Strukturen -- es wurden immer 100 Strukturen gleichzeitig aus einem Parametersatz berechnet -- analysiert und die korrigierten und überprüften Parameter wieder in die Berechnungen eingesetzt (Kapitel 6.3). Die Struktur der zweiten Domäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor ist durch dieses Verfahren sehr gut definiert, was sich in den Werten der Standardabwei­ chung für die 10 besten Strukturen für den Backbone (1,4 Å) niederschlägt (Kapitel 6.4). Die so bestimmte Struktur beweist die Annahme, daß es sich bei der zweiten Do­ mäne des TFPI auch strukturell um einen typischen Kunitz­Inhibitor (Kapitel 2.1) handelt, was durch punktuelle Mutationen im Bereich der reactive site bereits funktionell bewiesen war. Die Stabilität der Protease­Inhibitoren gegenüber Verdau und Entfaltung begründet sich in der kompakten Struktur, die durch 3 Disul­ fidbrücken stabilisiert wird. Die sechs stets 1 gleichweit voneinander in der Sequenz entfernten Cysteine verbinden N­ und C­Terminus (Cys­5 -- Cys­55 in der BPTI­ Numerierung), stabilisieren die reactive site (Cys­14 -- Cys­38) und binden das zentrale Faltblatt an den Rest des Moleküls. Die für Kunitz­Inhibitoren typische Struktur ist im untersuchten Protein bewahrt; weniger gut definiert ist die in eini­ gen Inhibitoren dieses Typs zu findenden N­-terminale Alpha­Helix, sie ist in den Struk­ turen des TFPI­2 lediglich angedeutet. Ein Vergleich der Struktur des TFPI­2, so wie es in dieser Arbeit untersucht wurde, und der Struktur eines Homologen findet in Kapitel 6.4.3 statt. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß die strukturelle Untersuchung des kleinen, un­ markierten Proteins erfolgreich durchgeführt werden kann. Die Struktur des phar­ makologisch interessanten Moleküls sollte ein Hilfsmittel bei der Auffindung von neuen, den körpereigenen ähnlichen und damit besser verträglichen Gerinnungs­ inhibitoren sein. Die neuen NMR­Methoden bieten ein innovatives Werkzeug zur Gewinnung von skalaren Kopplungskonstanten mit hoher Effizienz und unter Umgehung der Probleme, die in COSY­Spektren mit hohen Linienbreiten auftreten.