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Lei Zhao

• The application of natural products (NPs) as drugs and lead compounds has greatly improved human health over the past few decades. Despite their success, we still need to find new NPs that can be used as drugs to combat increasing drug resistance via new modes of action and to develop safer treatments with less side effects. Entomopathogenic bacteria of Xenorhabdus and Photorhabdus that live in mutualistic symbiosis with nematodes are considered as promising producers of NPs, since more than 6.5% of their genomes are assigned to biosynthetic gene clusters (BGCs) responsible for production of secondary metabolites. The investigation on NPs from Xenorhabdus and Photorhabdus can not only provide new compounds for drug discovery but also help to understand the biochemical basis involved in mutualistic and pathogenic symbiosis of bacteria, nematode host and insect prey. Nonribosomal peptides (NRPs) are a large class of NPs that are mainly found in bacteria and fungi. They are biosynthesized by nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) and display diverse functions, representing more than 20 clinically used drugs. Although a large number of NRPs have been identified in Xenorhabdus and Photorhabdus, the advanced genome sequencing and bioinformatic analysis indicate that these bacteria still have many unknown NRPS-encoding gene clusters for NRP production that are worth to explore. Therefore, this thesis focuses on the discovery, biosynthesis, structure identification, and biological functions of new NRPs from Xenorhabdus and Photorhabdus. The first publication describes the isolation and structure elucidation of seven new rhabdopeptide/xenortide-like peptides (RXPs) from X. innexi, incorporating putrescine or ammonia as the C-terminal amines. Bioactivity testing of these RXPs revealed potent antiprotozoal activity against the causative agents of sleeping sickness (Trypanosoma brucei rhodesiense) and malaria (Plasmodium falciparum), making them the most active RXP derivatives known to date. Biosynthetically, the initial NRPS module InxA might act iteratively with a flexible methyltransferase activity to catalyze the incorporation of the first five or six N-methylvaline/valine to these peptides. The second publication focuses on the structure elucidation of seven unusual methionine-containing RXPs that were found as minor products in E. coli carrying the BGC kj12ABC from Xenorhabdus KJ12.1. To confirm the proposed structures from detailed HPLC-MS analysis, a solid-phase peptide synthesis (SPPS) method was developed for the synthesis of these partially methylated RXPs. These RXPs also exhibited good effects against T. brucei rhodesiense and P. falciparum, suggesting RXPs might play a role in protecting insect cadaver from soil-living protozoa to support the symbiosis with nematodes. The third publication presents the identification of a new peptide library, named photohexapeptide library, which occurred after the biosynthetic gene phpS was activated in P. asymbiotica PB68.1 via promoter exchange. The chemical diversity of the photohexapeptides results from unusual promiscuous specificity of five out of six adenylation (A) domains being an excellent example of how to create compound libraries in nature. Furthermore, photohexapeptides enrich the family of the rare linear D-/L-peptide NPs. The fourth publication concentrates on the structure elucidation of a new cyclohexapeptide, termed photoditritide, which was produced by P. temperata Meg1 after the biosynthetic gene pdtS was activated via promoter exchange. Photoditritide so far is the only example of a peptide from entomopathogenic bacteria that contains the uncommon amino acid homoarginine. The potent antimicrobial activity of photoditritide against Micrococcus luteus implies that photoditritide can protect the insect cadaver from food competitor bacteria in the complex life cycle of nematode and bacteria. The last publication reports a new family of cyclic lipopeptides (CLPs), named phototemtides, which were obtained after the BGC pttABC from P. temperata Meg1 was heterologously expressed in E. coli. The gene pttA encodes an MbtH protein that was required for the biosynthesis of phototemtides in E. coli. To determine the absolute configurations of the hydroxy fatty acids, a total synthesis of the major compound phototemtide A was performed. Although the antimalarial activity of phototemtide A is only weak, it might be a starting point towards a selective P. falciparum compound, as it shows no activity against any other tested organisms.
• Der Einsatz von Naturstoffen als klinisch genutzte Wirkstoffe oder Leitstrukturen hat in den letzten Jahrzehnten das Leben der Menschen in vielerlei Hinsicht beeinflusst und verbessert. Trotz bereits erzielter Erfolge und gleichzeitig durch sie „ermutigt“, müssen aber weitere Naturstoffe mit neuen Wirkmechanismen zur Bekämpfung verstärkt auftretender Resistenzen oder Wirkstoffe mit verbesserter Wirksamkeit bzw. Verträglichkeit gefunden werden. Entomopathogene Bakterien der Gattung Xenorhabdus und Photorhabdus leben in mutualistischer Symbiose mit Nematoden der Gattung Steinernema bzw. Heterorhabditis. Mehr als 6,5 % ihres Genoms codieren für Biosynthesegencluster (BGC), die für die Biosynthese von Naturstoffen, sogenannter Sekundärmetabolite, verantwortlich sind. Die Analyse der von Xenorhabdus und Photorhabdus gebildeten Naturstoffe führt einerseits zur Entdeckung einer Vielzahl biologisch aktiver Verbindungen und ermöglicht andererseits ein besseres Verständnis der biochemischen Abläufe in der Bakterium-Nematoden-Symbiose und der Entomopathogenität dieses Komplexes. Nematoden der Gattungen Steinernema bzw. Heterorhabditis haben einen komplexen Lebenszyklus: Bodenlebende, infektiöse Dauerlarven der Fadenwürmer beherbergen in ihrem Darm Bakterien der Gattung Xenorhabdus bzw. Photorhabdus. Sie dringen über den Darmkanal, das Tracheensystem oder durch Durchbrechen der Kutikula in das Insekt ein und geben ihre Bakterien in das Hemocoel ab. Aus dem infektiösen Stadium (IJ) entwickeln sich adulte, eierlegende Fadenwürmer (J4-Stadium). Die aus den Eiern geschlüpften Fadenwürmer durchlaufen den Zyklus J1-J4 etwa zwei- bis dreimal. Sind schließlich die Nährstoffe des Insektenkadavers verbraucht, entwickeln sich neue infektiöse Dauerformen, die von Bakterien besiedelt werden und zu Tausenden den Kadaver auf der Suche nach neuen Opfern verlassen. Die symbiotischen Bakterien tragen wesentlich zur Reproduktion der Nematoden bei. Ins Hemocoel ausgeschieden replizieren sie rasch und es kommt zu einer Sepsis des Insekts. Zur Verteidigung der Nahrungsquelle und damit auch zur Sicherstellung der eigenen und der Vermehrung und Entwicklung der Nematoden produzieren sie Naturstoffe, die das Immunsystem des Insekts überwinden und Toxine, die das Insekt innerhalb von 48 Stunden töten. Der Kadaver wird von den Bakterien durch die Produktion bioaktiver Verbindungen vor Fressfeinden wie anderen Bakterien, Pilzen und Protozoen geschützt. Gleichzeitig werden auch Substanzen produziert, die die Nematodenentwicklung unterstützen. Die genauere Erforschung der in diesem komplexen Lebenszyklus wirksamen Naturstoffe führt nicht nur zur Entdeckung neuer Wirkstoffe, sondern ermöglicht auch einen tieferen Einblick und Aufklärung der biochemisch ökologischen Aspekte dieser mutualistischen und pathogenen Symbiose zwischen Bakterium, Nematode und Insekt. In den letzten zehn Jahren wurden über 40 Naturstoffklassen in Xenorhabdus und Photorhabdus identifiziert, für deren Biosynthese nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS), Polyketidsynthasen (PKS) oder entsprechende NRPS-PKS-Hybride verantwortlich sind. NRPS sind große multimodulare Enzymkomplexe. Entsprechende Module bewirken die Aktivierung und Verknüpfung einzelner Aminosäuren zu einer Peptidkette. Jedes Modul enthält multiple Domänen, die verschiedene enzymatische Aktivitäten katalysieren: das Initiationsmodul einer NRPS besteht mindestens aus einer Adenylierungsdomäne (A) und einer Thiolierungsdomäne (T). Elongationsmodule enthalten eine zusätzliche Kondensationsdomäne (C). Ein Elongationsmodul besteht aus C-, A- und T-Domänen. Epimerisierungs- (E), Methyltransferase- (MT) und Formyltransferase- (FT) Domänen können als zusätzliche Domänen auftreten. Die von NPRS synthetisierten nicht-ribosomalen Peptide (NRP) bilden eine große Klasse der Naturstoffe, hauptsächlich synthetisiert von Bakterien und filamentösen Pilzen. Diese Peptide sind in ihrer Struktur vielgestaltig. Neben den 20 proteinogenen Aminosäuren sind auch bis zu 100 nicht-proteinogene Bausteine zu finden. Weitere Modifizierungen wie Acylierung, Glycosylierung oder Heterozyklisierung kann durch entsprechende Domänen der NRPS die chemische Struktur des NRP bestimmen. Je nach Aktivität der Terminations-Domäne einer NRPS kann die finale Struktur der Peptide linear oder zyklisch oder von zyklisch-verzweigter Struktur sein, wie z. B. makrozyklische Lactame oder Lactone. Bis zu 30 NRP sind derzeit in klinischer Anwendung und werden als Antibiotika, Fungizide, Krebsmedikamente oder Immunsuppressiva eingesetzt. Auch in Photorhabdus und Xenorhabdus bilden NRPS kodierende Biosynthesegencluster (BGC) die bisher größte Klasse der Naturstoffe. Diese strukturell und funktional vielfältigen Peptide sind entscheidend für den komplexen Lebenszyklus von Bakterien und Nematoden. Durch Genomsequenzierungen der Bakterien und anschließender bioinformatischer Analyse gelingt das Auffinden zahlreicher bisher unbekannter Gencluster für die Biosynthese vielversprechender neuer NRP. Die Isolierung und Aufklärung korrespondierender Naturstoffe kann jedoch erschwert sein, wenn das Gencluster unter Laborbedingungen nur schwach exprimiert oder still ist, weil aktivierende Signale des natürlichen Ökosystems fehlen. Der Schlüssel zur Überwindung dieses Problems ist die gezielte Aktivierung der entsprechenden Gencluster. Hierzu wurden verschiedene Strategien wie der Austausch des natürlichen gegen einen induzierbaren Promotor und heterologe Expression angewendet. Nach der erfolgreichen Aktivierung der Naturstoffbiosynthese ist die Aufklärung ihrer chemischen Struktur über verschiedene analytische Methoden notwendig. ...