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Bettina Elshorst

• In der vorliegenden Arbeit wurde die dreidimensionale Struktur des CaM/C20W­ Komplexes mit Hilfe von heteronuklearer, mehrdimensionaler NMR­Spektroskopie ermittelt. Der stabile CaM/C20W­Komplex mit einer Bindungskonstanten KD = 11 nM besteht aus dem Protein CaM und dem Peptid C20W. CaM, ein kleines, saures Protein (16,7 kDa), das in allen eukaryontischen Zellen vorkommt und hantelförmig mit zwei Domänen aufgebaut ist, übermittelt die Signalwirkung von Calciumionen an eine Reihe von Zielenzymen. Durch die Bindung von CaM an die Plasmamembran Ca 2 ­ATPase wird das Calciumsignal wieder beendet. Das Peptid C20W entspricht dem N­terminalen Teil der Calmodulin­Bindungsdomäne der Ca 2 ­ATPase. Röntgenkleinwinkelstreu­ experimente an dem CaM/C20W­Komplex führten zu der Vermutung, daß das Peptid C20W nur an die C­terminale Domäne von CaM bindet und damit einen unterschiedlichen Bindungsmodus im Gegensatz zu den bekannten Calmodulin­ bindenden Peptiden zeigt. Zur Strukturbestimmung des CaM/C20W­Komplexes wurde eine Probe aus 13 C, 15 N­markiertem CaM und unmarkiertem C20W verwendet. Diese unterschiedliche Markierungsweise erlaubt die Unterscheidung beider Komponenten in den NMR­ Spektren. Für CaM wurden eine Serie von heteronuklearen, dreidimensionalen Tripelresonanzexperimente aufgenommen, die zunächst die Zuordnung der Resonanzen des Proteinrückgrats und dann auch der der Seitenketten erlaubte. Spezielle NMR­ Experimente wurden für die Zuordnung der neun Methionine durchgeführt, die bei der Bindung des Peptids eine wichtige Rolle spielen. Durch die Auswertung von NOESY Spektren wurden 1645 Abstands­restraints für CaM ermittelt, die sich in 794 intraresiduale, 387 sequentielle, 311 mittelreichweitige und 153 langreichweitige restraints aufteilen. Durch die Bestimmung der Temperaturkoeffizienten der Amidprotonen konnten 52 Wasserstoffbrücken von CaM zugeordnet werden. Durch doppeltgefilterte, homonukleare Korrelationsexperimente, bei denen die Protonen­ resonanzen von 13 C, 15 N­markiertem CaM unterdrückt werden, konnten die Resonanzen des unmarkierten Peptids C20W zugeordnet werden. Es wurden 163 NOE restraints ermittelt, wobei 102 intraresidual, 32 sequentiell und 29 mittelreichweitig waren. Schließlich konnten mit Hilfe eines halbgefilterten NOESY­Experiments 49 intermolekulare NOE's zwischen CaM und C20W zugeordnet werden. Außerdem wurden neben den Abstands­restraints für CaM 129 Dihedralwinkel­restraints ermittelt. Die gesamte Zuordnung des CaM/C20W­Komplexes wurde in der Datenbank BioMagResBank mit der Nummer 4284 abgelegt (http://www.bmrb.wisc.edu/). Die experimentell gewonnenen restraints wurden in einer Moleküldynamik­Rechnung mit einem simulated annealing­Protokoll verwendet, wobei insgesamt 200 Strukturen berechnet wurden. Die 26 energieärmsten Strukturen wurden als repräsentativ ausgewählt und in der Brookhaven Protein Datenbank mit dem PDB ID­Code 1CFF abgelegt (http://www.rcsb.org/). Die 26 Strukturen weisen für die N­terminale Domäne einen RMSD­Wert von 0.75 Å über die Proteinrückgratatome und für die C­terminale Domäne zusammen mit dem Peptid C20W einen RMSD­Wert von 0.53 Å über die Proteinrückgratatome auf. Die hohe Konvergenz der Strukturen und gute Werte bei der Ramachandran­Statistik (73.7% in den erlaubten Bereichen) sprechen für eine gute Qualität der ermittelten Strukturen. Die ermittelte Struktur des CaM/C20W­Komplexes zeigte einen neuartigen Bindungsmodus des Peptids. C20W bindet nur an die C­terminale Domäne von CaM, die N­terminale Domäne ist nicht in der Bindung involviert. Diese Struktur steht damit im Gegensatz zu den bisher bekannten CaM/Peptid­Komplexen, bei denen das Peptid von beiden Domänen gebunden wird und ein globulärer Komplex entsteht. Der Bindungsmodus des C20Ws wurde zum einen durch chemische Verschiebungs­ differenzen der Amidprotonen und der Methionine ermittelt. Zum anderen konnten ausgehend von C20W intermolekulare NOE's nur zur C­terminalen Domäne von CaM zugeordnet werden. Die Sekundärstruktur von CaM ändert sich durch die Bindung des Peptids kaum. Beide Domänen, die zueinander homolog sind, bestehen aus vier alpha­Helices und einem kurzen antiparallelen beta­Faltblatt. Verbunden sind beide Domänen durch eine flexiblen Linkerbereich, wobei die Domänen zueinander keine Orientierung zeigen, da keine NOE's zwischen den Domänen gefunden wurden. Der ungewöhnliche Bindungsmodus des Peptids C20W steht im Einklang mit der Tatsache, daß die Plasmamembran Ca 2 ­ATPase bereits durch die C­terminale Domäne von CaM aktiviert werden kann. Der CaM/C20W­Komplex läßt sich daher als Schnappschuß auf dem Weg der vollständigen Aktivierung der Ca 2 ­ATPase durch CaM verstehen. Die Ergebnisse der NMR­spektroskopischen Untersuchung des CaM/C20W­Komplexes wurden in (1999) Biochemistry 38, 12320­12332 veröffentlicht. Die Publikation ist im Anhang (Kapitel 6.9) beigefügt. Um die Orientierung der Domänen des CaM/C20W­Komplexes zueinander zu untersuchen, sind weiterführende Experimente geplant. Hierzu sollen Messungen an einem CaM/C20W­Komplex unternommen werden, der am N­Terminus des Peptids einen paramagnetischen Marker trägt, wobei dipolare Kopplungen und Pseudo­ kontaktshifts ermittelt werden sollen. Weiterhin sind ähnliche Untersuchungen an einem CaM/C20W­Komplex geplant, der am N­Terminus von CaM einen paramagnetischen Marker trägt. Mit diesen Experimenten sollte es gelingen, die Frage der Domänen­ orientierung zu klären.