Expression and characterization of P-type ATPases for structural studies

Two types of proteins transport ions across the membrane – ion channels and ion pumps. Ion pumps transport ions against their electrochemical gradient by co-transporting another ion or a substrate molecule through a conc
Two types of proteins transport ions across the membrane – ion channels and ion pumps. Ion pumps transport ions against their electrochemical gradient by co-transporting another ion or a substrate molecule through a concentration gradient or by coupling this process to an energy source like ATP. Those that couple ATP hydrolysis to ion transport are called ion motive ATPases and can be classified as ‘V’, ‘F’ and ‘P’ types. In this thesis, two sub-classes of P-type ATPases, PIIIA and PIB were studied. Attempts were made to over-express and crystallize the plant proton pump AHA2 (a PIIIA-ATPase). Also, the two putative copper transporting ATPases, CtrA3 (CopB-like) and CtrA2 (CopA-like) from Aquifex aeolicus (both PIB pumps) were over-expressed in E. coli and characterized. PIIIA-type pumps transport protons across the membrane and are found exclusively in plants and fungi, and probably some archaea. One of the most characterized proton pump biochemically is the A. thaliana proton pump AHA2. An 8Å projection map of this enzyme is already available (Jahn 2001). PIBATPases, also called CPX type pumps transport heavy metal ions such as Cu+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Cd2+, Co2+ across biological membranes and play an important role in homeostasis and biotolerance of these metals. CopA and CopB are two such proteins that transport copper across cell membrane found in many prokaryotes. CopB-like proteins are found almost exclusively in bacteria, with CPH sequence motif, while CopA-like proteins have CPC sequence motif, also found in eukaryotic copper transporters including human ATP7A and ATP7B. CopB extrudes Cu2+ across the membrane. CopA is activated by and transports Cu+ but the direction of transport is debated. Attempts were made to over-express the plant proton pump AHA2 in yeast Pichia pastoris. However, the yeast expressed only a truncated protein, which could not be used for further studies. It can be concluded that P. pastoris strain SMD1163 is not a good host for expression of AHA2. Focus was then shifted to AHA2 that has been over-expressed and purified from S. cerevisiae strain RS72. Growth and purification protocols had to be changed from published methods because of laboratory constraints and this probably had an effect on the protein produced. The protein purified from S. cerevisiae could not be crystallized reproducibly for structural studies by electron microscopy. CtrA3 was expressed in E. coli and purified using Ni2+-NTA matrix. Like CopB of A. fulgidus (Mana Capelli 2003), it was active only in the presence of Cu2+ and to some extent in Ag+. The protein was maximally active at 75°C, at pH 7 and in presence of cysteine. Lipids were essential for the activity of CtrA3. However, when the protein was purified in Cymal-6, CtrA3 could not hydrolyze ATP, even when lipids were added to the reaction mixture. For reconstitution of CtrA3 into liposomes for 2D crystallization, several lipids were tested. To screen the lipids compatible for protein incorporation, CtrA3 was dialyzed with different lipids at a high lipid-to-protein ratio of 10:1 and centrifuged by sucrose density gradient. Protein incorporated in lipids localized with liposome fraction in the gradient. Most of the CtrA3 was incorporated into DPPC with no aggregation. This lipid was used for reconstitution of CtrA3 at low LPRs, and at an LPR of 0.3-0.5, the protein formed 2D crystals. A NaCl concentration of 50mM was necessary for the formation of crystals. However, salt removal by dialysis prior to harvesting was essential for obtaining wellordered lattices of CtrA3. Addition of preservatives like trehalose and tannin or direct plunging in liquid ethane for cryo-microscopy destroyed the crystal lattice. Similar to CtrA3, the gene responsible for expression of CtrA2 was amplified from genomic DNA of A. aeolicus and expressed in E. coli and purified by Ni2+-NTA. Functional characterization of CtrA2 was done by analyzing ATP hydrolysis activity of the enzyme. Similar to CopA of A. fulgidus (Mandal 2002), CtrA2 was activated in the presence of Ag+ and to some extent, Cu+. It is possible that both the copper ATPases of A. aeolicus have different ion selectivity- CtrA3, specific for Cu2+ and CtrA2, specific for Cu+. Maximal activity of CtrA2 was also at 75°C. Cysteine was essential for activity of CtrA2, but the protein was not dependent on addition of lipids for activation. Reconstitution of CtrA2 was done similar to CtrA3 for screening of lipids for 2D crystallization. Of the lipids tested, DOPC reconstituted the protein best. However, screening at low LPRs did not yield any crystals. Even though both CtrA3 and CtrA2 are similar heavy metal transporting Ptype ATPases from the same organism and have 36% identity, they behaved completely different in their expression levels in E. coli, purification profiles, activity and reconstitution in lipids.
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Membranproteine führen eine Vielfalt von Funktionen aus, zu welchen unter anderem der Transport von Molekülen über die Membran gehört, entweder zum Erhalt des Gleichgewichts von löslichen Stoffen, oder um diese gegen ein
Membranproteine führen eine Vielfalt von Funktionen aus, zu welchen unter anderem der Transport von Molekülen über die Membran gehört, entweder zum Erhalt des Gleichgewichts von löslichen Stoffen, oder um diese gegen einen Konzentrationsgradienten als Nahrungsmittelquelle für die Zelle zu importieren. Es existieren zwei Typen von Proteinen, um Ionen über die Membran zu transportieren, Ionenkanäle und Ionenpumpen. Ionenpumpen transportieren Ionen gegen ihren elektrochemischen Gradienten entweder durch Co-Transport eines anderen Ions oder durch Prozessierung einer Energiequelle wie z.B. ATP (Adenosintriphosphat). Diejenigen, welche ATP Hydrolyse mit einem Ionentransport koppeln sind die sogenannten „Ionen bewegenden ATPasen“. Mindestens drei verschiedene Klassen von ATPasen können in verschiedenen biologischen Membranen gefunden werden, die ‚V’-Typ, die ‚F’-Typ und die ‚P’-Typ ATPasen. Die Superfamilie der P-Typ ATPasen stellt eine grosse und ubiquitäre Gruppe von Membranproteinen dar, welche eine Rolle bei dem Transport von geladenen Substraten über biologische Membranen spielen. Alle P-Typ ATPasen teilen sich die Gemeinsamkeiten eines konservierten Aspartat-Restes, der während des Reaktionszyklus phosphoryliert wird, eines konservierten Prolin-Restes, der innerhalb des Ionentranslokationsweges in der Membran liegt und Konsensus-Domänen für die ATP Bindung und den Energie-Transfer. Die P-Typ ATPase-Superfamilie hat fünf Zweige, PI bis PV, die sich durch ihre Substrat-Spezifitäten unterscheiden. Innerhalb dieser Zweige können verschiedene Sub-Typen unterschieden werden. In dieser Arbeit wurden zwei Sub-Klassen von P-Typ ATPasen untersucht, PIIIA und PIB. Versuche zur Überexpression und Kristallisation der Protonen Pumpe AHA2 aus Pflanzen (PIIIA-ATPase) wurden durchgeführt. Zusätzlich wurden die zwei vermeintlich Kupfer-transportierenden ATPasen CtrA3 und CtrA2 aus Aquifex aeolicus (beides PIB Pumpen, die ähnlich zu CopA und CopB aus Archaeoglobus fulgidus stammen) in Escherichia coli überexprimiert und charakterisiert. PIIIA-Typ Pumpen wurden exklusiv in Pflanzen und Pilzen, wahrscheinlich auch in Archaea gefunden und transportieren Protonen über die Membran. Eine der biochemisch am besten charakterisierten Protonenpumpen dieses Types ist AHA2 aus Arabidopsis thaliana. Eine Projektionskarte bei 8 Å Auflösung dieses Enzyms zeigt bemerkenswerte Ähnlichkeit mit der Ca2+-ATPase, für welche eine 3D Struktur bei 2.6 Å Auflösung bekannt ist. PIB-ATPasen, auch CPX-Typ Pumpen genannt, transportieren Schwermetall-Ionen wie z.B. Cu+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Cd2+ und Co2+ über biologische Membranen und spielen eine wichtige Rolle bei der Homöostase und Biotoleranz dieser Ionen. Mutationen in den zwei nahe verwandten menschlichen Proteinen ATP7A und ATP7B, welche Kupferionen über die Membran transportieren, verursachen die tödlichen Menkes- und Wilson-Krankheiten. Homologe von diesen Proteinen wurden in vielen Organismen gefunden, unter anderen in Bakterien und Archaea. CopA und CopB sind zwei Proteine dieses Typs, die Kupferionen über die Zellmembran transportieren. CopB-ähnliche Proteine können fast ausschließlich in Bakterien gefunden werden, mit einem CPH-Motiv, während CopA-ähnliche Proteine ein CPC-Motiv haben und auch in eukaryontischen Kupferionen-Transportern gefunden werden, inklusive dem menschlichen ATP7A und ATP7B. Für CopB wurde vorgeschlagen, dass es Cu2+ über die Membran transportiert und experimentell konnte der Export von diesen Ionen gezeigt werden. CopA wird aktiviert und transportiert Cu+, aber der Export dieses Ions konnte bisher noch nicht direkt gezeigt werden. Trotzdem deutet indirekte Evidenz darauf hin, dass dieses Protein beim Import von Cu+ in prokaryontische Zellen involviert sein könnte. 1. AHA2: Es wurden Versuche zur Überexpression der pflanzlichen Protonenpumpe AHA2 in der Hefe Pichia pastoris unternommen. Nur eine abgeschnittene Version von AHA2 wurde in diesem Wirt exprimiert und konnte deshalb nicht für weitere Studien gebraucht werden. P. pastoris Stämme scheinen kein geeigneter Wirt für die Expression von AHA2 zu sein. Der Fokus dieser Arbeit wurde dann auf AHA2 verschoben, welches im Saccharomyces cerevisiae Stamm RS72 exprimiert und gereinigt wurde. Die Expression der Protonenpumpe PMA1 im Wirt wurde unter die Regulation eines Galaktose-Promotors gesetzt und die pflanzliche Protonenpumpe AHA2 wurde via eines pma1-Promotor enthaltenden Plasmids eingeführt. Die Wachstums- und Reinigungsprotokolle mussten aufgrund von Laborbeschränkungen von der publizierten Methode abgwandelt werden, was vermutlich einen Effekt auf das produzierte Protein hat. Das gereinigte Protein aus S. cerevisiae konnte nicht für strukturelle Untersuchungen mit Elektronenmikroskopie reproduzierbar in 2D kristallisiert werden. 2. CtrA3: Das Gen, welches für die Expression von ctrA3 aus A. aeolicus zuständig ist, wurde aus genomischer DNA mit Hilfe von PCR amplifiziert und in verschiedene Expressionsvektoren zur Expression in E. coli kloniert. Es konnte keine Expression in den Klonen untersucht werden, bei denen kein tag am Nterminus vorhanden war. Die beste Expression konnte im E. coli Stamm RPCodon Plus erreicht werden, im Plasmid pET28A, mit His- und T7 tags am Nterminus von CtrA3. Die transformierten Zellen brauchten keine Induktion; Wachstum der Zellen über Nacht bei 37°C war ausreichend für die Proteinexpression. Ungefähr 1.2 bis 1.5 mg/ml reines Protein konnten aus 1 L einer über Nacht angewachsenen Kultur gewonnen werden. Das exprimierte Protein wurde anhand einer Ni2+-NTA Matrix gereinigt, unter Ausnutzung des His-tags, welcher auf dem rekombinanten Protein präsent war. CtrA3 wurde in n-Dodecyl-beta-D-maltosid solubilisiert und gereinigt. Das Protein konnte auch in Gegenwart von anderen Detergenzien gereinigt werden, wie z.B. Cymal-6 und n-Octyl-beta-D-glucopyranosid. Das in Octyl-beta-Dglucopyranosid gereinigte CtrA3 war dennoch keine 24 Stunden stabil. Das in Cymal-6 gereinigte Protein war zwar stabil, mit Hilfe von Gelfiltration konnte aber festgestellt werden, dass es nicht so monodispers ist, wie das in n-Dodecyl-beta-Dmaltosid gereinigte CtrA3. CtrA3 wurde auf seine Hydrolyse-Aktivität hin getestet. Ähnlich wie CopB war es nur in der Gegenwart von Cu2+ aktiv und zu einem Teil auch in der Gegenwart von Ag+. Nur oberhalb einer Temperatur von 50°C war CtrA3 aktiv. Die maximale Aktivität von CtrA3 konnte bei 75°C, bei pH 7.0 und mit Cystein gemessen werden. Für die Aktivität von CtrA3 waren Lipide entscheidend; es konnte keine ATP Hydrolyse ohne diese detektiert werden. Das Protein war vollständig aktiv, als L-alpha-Phosphatidyl-cholin aus Sojabohnen zur Reaktion zugegeben wurde. Trotzdem konnte CtrA3 kein ATP hydrolysieren nachdem das Protein in Cymal-6 gereinigt wurde, nicht einmal bei Zugabe von Lipiden zur Reaktionslösung. Obwohl CtrA3 in Abwesenheit von Salz aktiv war, konnte die maximale Aktivierung des Enzyms bei 400 mM NaCl erreicht werden. Mehrere Lipide wurde zur Rekonstitution von CtrA3 in Liposomen für die 2D Kristallisation getestet. Um die Lipid-Kompatibilität bezüglich der Protein Inkorporation zu überprüfen, wurde CtrA3 mit verschiedenen Lipiden mit einem hohen Lipid-zu-Protein Verhältnis von 10:1 und mit anschliessender Zentrifugation auf einem Zucker-Dichtegradienten dialysiert. Im Gradienten konnten die in die Lipide inkorporierten Proteine in der Liposomenfraktion gefunden werden. Ein Grossteil von CtrA3 wurde in 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ohne irgendwelche Aggregation inkorporiert. Dieses Lipid wurde dann auch für die Rekonstitution von CtrA3 bei einem tiefen Lipid-Protein Verhältnis gebraucht, und bei einem Lipid-Protein Verhältnis von 0.3 bis 0.5 konnte ein 2D-kristallines Gitter untersucht werden. Zur Ausbildung von Kristallen war NaCl unerlässlich, aber die am besten geordneten Kristalle konnten gefunden werden, als das Salz vor dem Sammeln durch Dialyse entfernt wurde. Die Zugabe von Schutzmitteln wie Trehalose und Tannin, oder das direkte Eintauchen der Kristalle in flüssiges Ethan war nachteilig für das Kristallgitter. Nicht-herkömmliche Schutzmittel wie Glycerin könnten deshalb zu einem besseren Gefrierschutz getestet werden. Das in Cymal-6 gereinigte CtrA3 wurde für das 3D Kristallisationsscreening verwendet. Dennoch konnten bisher keine 3D Kristalle gefunden werden, einige vielversprechende Bedingungen, bei denen Mikro-Nadeln und Spherulite gesichtet wurden, konnten allerdings identifiziert werden. Versuche zur Optimierung dieser Screens resultierten in keiner Verbesserung der 3D Kristalle. Das in n-Dodecyl-beta-D-maltosid gereinigte CtrA3 war nicht optimal für 3D Kristallisation, da ein grosser Anteil des Proteins auch bei einer hohen Konzentration von 15 mg/ml in den kommerziellen 3D Kristallisations-screens immer noch komplett gelöst war. 3. CtrA2: Ähnlich wie bei ctrA3 wurde das Gen ctrA2 aus der genomischen DNA von A. aeolicus amplifiziert und in E. coli exprimiert. CtrA2 wurde ebenfalls nicht exprimiert ohne einen zusätzlichen N-terminalen tag. Die beste Expression konnte mit T7- und His-tags am N-Terminus, im E. coli Stamm RP-Codon Plus mit dem Plasmid pET28A erhalten werden. Das exprimierte Protein wurde in Anwesenheit von n-Dodecyl-beta-D-maltosid solubilisiert und gereinigt. Es war nur zusammen mit Glycerin in der Detergens-Lösung stabil. Das Protein war nicht sehr homogen als es durch eine Superdex-200 Gelfiltrationssäule gereinigt wurde. Weder die Reinheit noch die Homogenität konnte verbessert werden, als CtrA2 mit Cymal-6 gereinigt wurde. Die funktionelle Charakterisierung von CtrA2 wurde anhand der ATP Hydrolyse Aktivität untersucht. Ähnlich wie bei dem A. fulgidus-homologen CopA wurde CtrA2 durch Ag+ aktiviert. Es konnte nur eine minimale ATP Hydrolyse Aktivität in der Anwesenheit von Cu2+ festgestellt werden. Cystein war unbedingt notwendig für die Aktivität von CtrA2. Die maximale Aktivierung dieses Enzyms konnte bei pH 7.5 gemessen werden. Maximale Aktivität von CtrA2 wurde bei einer NaCl Konzentration von 400 mM gefunden, ähnlich wie bei CtrA3. Es ist möglich, dass beide Kupfer-ATPasen von A. aeolicus eine unterschiedliche Ionenspezifität haben, CtrA3 spezifisch für Cu2+ und CtrA2 spezifisch für Cu+. Die maximale Aktivierung von CtrA2 wurde auch bei 75°C untersucht, aber dieses Enzym zeigte einen breiteren Temperaturbereich für die Aktivität als CtrA3; im Unterschied zu CtrA3, bei welchem erst bei über 50°C Aktivität gemessen werden konnte, war CtrA2 schon oberhalb von 30° aktiv. Dieses Protein zeigte weder eine Abhängigkeit der Aktivität durch die Zugabe von Lipid zur Probe. Noch hatte die Zugabe von verschiedenen Lipiden irgendeinen Effekt auf die Aktivität. Die Rekonstitution von CtrA2 wurde ähnlich wie bei CtrA3 durch das Testen verschiedener Lipide für die 2D Kristallisation durchgeführt. Bei einem hohen Lipid-Protein Verhältnis rekonstituierte CtrA2 am besten in 1,2-Dioleoylsn-Glycero-3-Phosphocholin. Das Testen eines tiefen Lipid-Protein Verhältnisses und das Wechseln der Bedingungen wie die Temperatur, der pH und die Pufferkomponenten ergaben keine Kristalle. Obwohl beide, CtrA3 und CtrA2, ähnliche Schwermetall-transportierende P-Typ ATPasen vom gleichen Organismus sind und 36% Identität teilen, verhalten sie sich komplett unterschiedlich bezüglich ihres Expressions-Grades in E. coli, ihres Reinigungsprofils, ihrer Aktivität und bezüglich ihrer Rekonstitution in Lipiden. Es konnten 2D Kristalle von CtrA3 erzielt werden. In der Zukunft sollte die Elektron Kryo-Mikroskopie von CtrA3 weitere Einsichten in die Anordnung der Helices dieses Proteins geben; bisher gibt es keine einzige Schwermetall-transportierende P-Typ ATPase, bei der es Belege über die helikale Anordnung der Helices gibt. Zur Konstruktion eines 3-dimensionalen Modells dieses Proteins müssen mit Kippwinkel-Bilder erstellt und prozessiert werden. Nach der Untersuchung der Reinigung und Stabilität des Proteins in anderen Detergenzien kann 3D-Kristallisation versucht werden. Bei CtrA2 könnte die Analyse einer breiteren Anzahl von Lipiden oder Mixturen von Lipiden helfen, das Protein in 2D zu kristallisieren.
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Metadaten
Author:Sivaram Chandra Chintalapati
URN:urn:nbn:de:hebis:30-48761
Referee:Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2007/09/26
Year of first Publication:2007
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2007/03/26
Release Date:2007/09/26
HeBIS PPN:190635274
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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