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Aleksandra Nevmerzhitskaya

• The overall survival for patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL) often is the function of age, in particular in 2019 analysis revealed that 5-year overall survival for patients older than 20 years remains below 35% (American Cancer Society, Cancer Facts &Figures 2019). Importantly, one of the major issues in ALL therapy is the ability of tumor cells to escape the treatment via the establishment of an immunosuppressive environment. The tumor microenvironment has gained tremendous importance in the past decade. This is largely based on the reasoning that, in order to devise better therapeutic strategies for patients, we need to gain better understanding into how malignant cells transform their microenvironment to promote growth, escape immune control and gain therapeutic resistance. TAM receptors (TAMRs) are engaged in innate immune cells as a feed-back mechanism to terminate the immune response and promote the return to homeostasis (Rothlin et al. 2007). In the context of cancers, aberrant TAMR signaling was mainly explored concerning its pro-oncogenic function (Paolino and Penninger 2016). There are only limited data available suggesting the modulation of cancer immune response via TAMR signaling in highly immunogenic solid tumor models (Paolino et al. 2014; Ubil et al. 2018). So far, however, little is known about their potential indirect immune-modulatory function in hematological malignancies. Taking into account the pronounced importance of TAMR signaling in immune cells combined with the leukemic immune tolerance, the current study focused on the function of TAMR and their ligands in anti-leukemic immunity. This work uncovers the mechanism of dampening anti-leukemic immune response via TAMR signaling on macrophages using the syngeneic BCR-ABL1 B-ALL mouse model. Using genetic depletion of GAS6 in the host environment or ablation of AXL and/or MERTK receptors in macrophages the bone marrow microenvironment could be rewired in order to achieve an efficient anti-leukemic immune response. In particular, the GAS6/AXL blockade triggers an effective NKand T- cell-dependent anti-leukemic response that results in prolonged survival. This finding specifically tackles the obstacle of inefficient bridging between innate and adaptive immune response typical for hematological malignancies in contrast to solid tumors (E. K. Curran, Godfrey, and Kline 2017). Besides establishing the vital function of TAMR signaling in anti-leukemic immunity using murine models, the analysis of human blood plasma revealed that age-related immune dysregulation was manifested by significant GAS6 decrease and PROS1 upregulation among elderly donors (>60 y.o.) compared to controls (<25 y.o.). These data are indicative that TAMR signaling likely favors the age-dependent immune system decline, which in turn is associated with a poor survival rate of elderly patients diagnosed with leukemia. In conclusion, using a preclinical ALL model here it was identified in vivo, that Axl significantly increases upon B-ALL challenge in Mph and NK cells. Therefore, AXL targeting, using the orally bioavailable selective inhibitor Bemcentinib, could serve as a powerful approach to revert early immunosuppression created by leukemia. Taken together these data propose the AXL receptor as a novel immune checkpoint and attractive candidate for the development of a new therapeutic approach via unleashing the patient’s own immune system to combat leukemic cells.
• Die Lebenserwartung von Patienten mit akuter lymphoblastische Leukämie (ALL) hängt häufig vom Alter ab. Insbesondere ergab eine Studie aus dem Jahr 2019 , dass das 5-Jahres-Gesamtüberleben für Patienten über 20 Jahre unter 35% liegt (American Cancer Society, Cancer Facts & Figures 2019). Dabei ist eines der Hauptprobleme bei der ALL-Therapie die Fähigkeit maligner Zellen, der Behandlung durch die Schaffung einer immunsuppressiven Umgebung zu entkommen. Daher hat die Erforschung der Tumor-Mikroumgebung in den letzten zehn Jahren enorm an Bedeutung gewonnen. Um gezielte Therapiestrategien für Patienten zu entwickeln, ist ein besseres Verständnis, wie maligne Zellen ihre Umgebung transformieren und so ihr Wachstum fördern, der Immunregulation entkommen und therapeutische Resistenzen entwickeln, eine Grundvoraussetzung. TAM-Rezeptoren (TAMRs) sind bei der angeborenen Immunantwort als Rückkopplungsmechanismus beteiligt, um diese zu beenden und die Rückkehr zur Homöostase zu fördern (Rothlin et al. 2007). Im Zusammenhang mit Krebserkrankungen wurde die aberrante TAMR-Signalübertragung hauptsächlich im Hinblick auf dessen pro-onkogene Funktion untersucht. Insbesondere wurde der Zusammenhang der Expression von TAMRs und ihrer Liganden mit erhöhter Tumorproliferation, dem Überleben, der Therapieresistenz, der Metastasierung und der Tumorinvasion identifiziert (Paolino und Penninger 2016). Es liegen allerdings nur begrenzt Daten vor, die auf eine Modulation der Immunantwort über die TAMRSignalübertragung in hoch immunogenen soliden Tumormodellen hinweisen (Paolino et al. 2014; Ubil et al. 2018). Auch ist bisher wenig über ihre mögliche indirekte immunmodulierende Funktion bei hämatologischen Neoplasienbekannt. Unter Berücksichtigung der entscheidenden Bedeutung der TAMRSignalübertragung in Immunzellen in Kombination mit der leukämischen Immuntoleranz konzentriert sich diese Arbeit auf die Funktion von TAMRs und ihren Liganden bei der anti-leukämischen Immunität. Zur Untersuchung der leukämischen Immunantwort wurde das aggressive murine B-ALL-Modell verwendet, das einen in der Klinik beobachteten aggressiven Rezidivphänotyp genetisch rekapituliert, indem es neben dem BCR-ABL1- (BA) Fusionstranskript sich durch den Verlust von CDKN2A (Arf-/-) und heterozygoten Knockout von IKZF1 (IkarosL/+) auszeichnet (Mullighan et al. 2009). Zunächst wurde eine mögliche direkte bzw. immunmodulierende Wirkung von GAS6, einem TAMRLiganden, untersucht. Dazuwurden B-ALL-Zellen sowohl in immunkompetente als auch immundefiziente Gas6-/- Rezipienten transplantiert. Dieser Ansatz ergab eine immunabhängige Wirkung, da in Abwesenheit von GAS6 das Überleben immunkompetenter, nicht aber immundefizienter Empfänger, deutlich verlängert war. Darüber hinaus gab es trotz der Expression vom TAMR TYRO3 auf der Oberfläche von Leukämiezellen in Abwesenheit von GAS6 bei immundefizienten NSG-Mäusen keine Veränderung der Tumorzellproliferation, so dass eine direkte Wirkung ausgeschlossen werden konnte. Ferner wurde gezeigt, dass das Fehlen von GAS6 im immunkompetenten Wirt zu einer Verschiebung myeloider Zellen in Richtung des M1-Phänotyps führt, was zu einer T-Zell-abhängigen Immunantwort gegen die Leukämie führt. Interessanterweise kam es beim konstitutiven Gas6-Knockout über die Zeit zu einer Kompensation der Abwesenheit von GAS6 und führte zu einer Zunahme der Genexpression des alternativen TAMR-Liganden Pros1 um das Vierfache. In diesem Zusammenhang wurde auch gezeigt, dass die Pros1-Hochregulation in Verbindung mit der aggressiveren genetischen B-ALLVariante (BA+Arf-/-IkarosL/+) instruktiv induziert wurde, wodurch der Gas6-/--Effekt vollständig kompensiert wurde. Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass beide TAMR-Liganden, GAS6 und PROS1, im Kontext des präklinischen BA+ BALL-Modells eine tiefgreifende immunsuppressive Rolle spielen. Um weitere zelluläre Effektoren zu identifizieren, die GAS6 und PROS1 nachgeschaltet sind, wurde die Csf1r-Cre+Axlf/f Mauslinie, die sich durch die Abwesenheit des TAMR AXL auf CSF1R-exprimierenden Zellen auszeichnet, als Rezipient für BA+ B-ALL-Zellen verwendet. Dieses Mausmodell wurde insbesondere aufgrund des Targetings von mononukleären Phagozyten ausgewählt, wobei die Population das höchste Expressionsniveau von TAMRs in hämatopoetischen Zellen aufweist. Die Endpunkt- und Überlebensanalyse, die nach der B-ALL-Transplantation in Csf1r-Cre+Axlf/f -Tiere gegenüber der Cre-negativen Kontrollkohorte durchgeführt wurde, hat einen beispiellosen Leukämieschutz der Csf1r-Cre+ Axlf/f -Gruppe bestätigt. Die entscheidende Rolle von Makrophagen für diesen Mechanismus wurde durch Depletion dieser Zellen bestätigt. Die Behandlung von Csf1r-Cre+ Axlf/f -Mäusen mit Clodronat vor Transplantation der B-ALL-Zellen führte zum kompletten Verlust des Leukämieschutzes Damit wurden Makrophagen als essentielles Kompartiment zur Erhöhung der Immunität gegen B-ALL identifiziert. Darüber hinaus konnte die antileukämische Aktivität von Makrophagen ex vivo mittels Blockade von AXL durch Bemcentinib-Behandlung (selektiver AXL-Inhibitor) von M1-polarisiertem Wildtyp-Makrophagen rekapituliert werden. Dies führte zu einer signifikant erhöhten Produktion der wichtigsten proentzündlichen Zytokine TNFa und IL-12, während Socs3, welches über TAMR induziert wird, deutlich gehemmt wurde. Bemerkenswerterweise bestätigt die genetische in-vivo-Depletion von Socs3 in Csf1R-exprimierenden Makrophagen die Axl-Ablation. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass die Immunantwort von Makrophagen durch die Blockade von AXL zumindest teilweise über eine verstärkte entzündliche Zytokinproduktion erreicht wird. Neben der entscheidenden Rolle von Makrophagen konnte in dieser Arbeit weiterhin gezeigt werden, dass natürliche Killerzellen (NK-Zellen) für die anti-leukämische Immunität von entscheidender Bedeutung sind und ihre Aktivität über die AXLSignalübertragung weitgehend unterdrückt wird. Obwohl die Axl-Expression in NKZellen im Normalzustand relativ gering ist, steigt sie in vivo nach Transplantation von B-ALL-Zellen wie auch bei Makrophagen signifikant an. Daher könnte eine spezifische Hemmung von AXL als wirksamer Ansatz dienen, um die durch die Leukämie verursachte frühe Immunsuppression umzukehren. Dieser Mechanismus konnte hier sowohl für das präklinische B-ALL- als auch für das Modell der akuten myeloischen Leukämie (AML) nachgewiesen werden. Es konnte damit gezeigt werden, dass die immunsuppressive Signalübertragung über TAMRs durch die Leukämie verstärkt wird, was in der Wildtyp-Situation zu einer frühen Inhibierung der proinflammatorischen angeborenen Immunantwort durch Makrophagen und NK-Zellen führt. Durch die Blockade der TAMR-Signalkaskade konnte hier die Inhibierung der Immunantwort durch die Leukämie aufgehoben werden und eine T-Zell-abhängige Immunantwort zur Bekämpfung der Leukämie induziert werden. Damit wurde die ineffiziente Induktion der adaptiven Immunantwort durch das angeborene Immunsystem überbrückt, was im Gegensatz zu soliden Tumoren für hämatologische Neoplasien typisch ist(E. K. Curran, Godfrey und Kline 2017). Diese Arbeit hat die entscheidende Funktion der TAMR-Signalübertragung als Suppressor der anti-leukämischen Immunität in präklinischen ALL-Modellen gezeigt. Um diese Resultate auf das humane System zu übertragen, wurde ein vollständig humanisiertes ex vivo-System verwendet. Hierfür wurde untersucht, wie sich das Expressionsniveau von GAS6 und PROS1 bei direktem Kontakt mit humanen primären Leukämiezellen in der humanen Knochenmarkumgebung (hämatopoetisches und stromales Kompartiment) verändert. Die zeitlich begrenzte Co-Kultur von humanen endothelialen Zellen und mesenchymalen Stammzellen mit von Patienten stammenden B-ALL-Zellen oder Proben von Patienten mit myelodysplatischen Syndrom (MDS) hat im Vergleich zur Co-Kultur mit gesunden Knochenmarkzellen keine signifikanten Veränderungen des Expressionslevels von GAS6 und PROS1 induziert. Interessanterweise wurde GAS6, jedoch nicht PROS1, in isolierten CD14+ Monozyten nach Co-Kultur sowohl mit Leukämiezellen als auch gesunden Knochenmarkzellen hochreguliert. Das deutet darauf hin, dass die GAS6-Induktion aufgrund einer unzureichenden HLA-Übereinstimmung auftrat. Daher erfordert dieser Aspekt weitere Untersuchungen unter Berücksichtigung der begrenzten Lebensdauer der primären humanen Leukämieproben ex vivo. Darüber hinaus wurde hier das Niveau von GAS6 und PROS1 im Blutserum von gesunden Spendern im Alter von unter 25 Jahren und über 60 Jahren analysiert. Diese Untersuchung ergab, dass sich eine altersbedingte Immunschwäche in der älteren Kohorte im Vergleich zur jungen Gruppe in signifikant verringerten GAS6-Spiegeln und erhöhten Werten für PROS1, CCL2/MCP1a, Eotaxin und CCL3/Mip1a-Spiegeln manifestiert. Diese Daten deuten darauf hin, dass die TAMR-Signalübertragung wahrscheinlich den altersabhängigen Rückgang des Immunsystems begünstigt, was wiederum mit einer schlechteren Überlebensrate bei älteren Leukämie-Patienten verbunden ist. Zusammenfassend identifiziert diese Arbeit den Mechanismus der Inhibierung der anti-leukämischen Immunantwort über die TAMR-Signalkaskade in Makrophagen unter Verwendung des syngenen BCR-ABL1 B-ALL-Mausmodells. Durch genetische Depletion von GAS6 in der Wirtsumgebung oder Ablation von AXLund/oder MERTK-Rezeptoren in Makrophagen wirdeine effiziente antileukämische Immunantwort induziert. Insbesondere löst die GAS6/AXL-Blockade eine wirksame NK- und T-Zell-abhängige Anti-Leukämie-Reaktion aus, die zu einem verlängerten Überleben führt. Zusammengenommen schlagen diese Daten den AXL-Rezeptor als neuartigen Immun-Checkpoint und attraktiven Kandidaten für die Entwicklung eines neuen therapeutischen Ansatzes vor, indem das eigene Immunsystem des Patienten gegen die Leukämie gerichtet wird.