Open Access

Adrian Kovač

• Two main types of methods are used in gene therapy: integrating vectors and nuclease-based genome engineering. Nucleases are site-specific and are efficient for knock-outs, but inefficient at inserting long DNA sequences. Integrating vectors perform this task with high efficiency, but their insertion occurs at random genomic positions. This can result in transformation of target cells, which leads to severe adverse events in a gene therapy context. Thus, it is of great interest to develop novel genome engineering tools that combine the advantages of both technologies. The main focus of this thesis is on generating such a targetable integrating vector. The integrating vector used in this project is the Sleeping Beauty (SB) transposon, a DNA transposon characterized by high activity across a wide range of cells. The SB transposase was combined with an RNA-guided Cas9 nuclease domain. This nuclease component was meant to direct transposase integration to specific targets defined by RNAs. The SB transposase was fused to cleavage-inactivated Cas9 (dCas9) to tether it to the target sites. In addition, adapter proteins consisting of dCas9 and domains non-covalently interacting with SB transposase or the SB transposon were generated. All constituent domains of these fusion proteins were tested in enzymatic assays and almost all enzymatic activities could be verified. Combining the fusion protein dCas9-SB100X with a gRNA binding a sequence from the AluY repetitive element resulted in a weak, but statistically significant enrichment around sites bound by the gRNA. This enrichment was ca. 2-fold and occurred within a 300 bp window downstream of target sites, or within the AluY element. Targeting with adapter proteins and targeting of other targets (L1 elements or single-copy targets) did not result in statistically significant effects. Single-copy targets tested included the HPRT gene and three specifically selected GSH targets that were known to be receptive to SB insertions. The combination with a more sequence-specific transposase mutant also failed to increase specificity to a level allowing targeting of single-copy loci. Genome-wide analysis of insertions however demonstrated, that dCas9-SB100X has a different insertion profile than SB100X, regardless of the gRNA used. As low efficiency of retargeting is likely a consequence of the high background activity of the SB100X transposase in the fusion constructs, a SB mutant with reduced DNA affinity, SB(C42), was generated. For this mutant, transposition activity was partly dependent on a dCas9 domain being supplied with a multi-copy target gRNA, specifically a 2-fold increase in the presence of a AluY-directed gRNA. Whether using this mutant results in improved targeting remains to be determined. In a side project, an attempt was made to direct SB insertions to ribosomal DNA by fusing the transposase to a nucleolar protein. This fusion transposase partially localized to nucleoli and insertions catalyzed by this transposase were found to be enriched in nucleolus organizer regions (NORs) and nucleolus-associated domains (NADs). The aim of a second side project was increasing the ratio between homology-directed repair (HDR) and non-homologous end-joining (NHEJ) at Cas9-mediated double-strand breaks (DSBs). To achieve this, Cas9 was fused to DNA-interacting domains and corresponding binding sequences were fused to the homology donors. While an increased HDR/NHEJ ration could be observed for the fusion proteins, it was not dependent on the presence on the binding sequences in the donor molecules.
• In der Gentherapie werden zwei Hauptgruppen von Methoden unterschieden: integrierende Vektoren und Nuklease-basiertes Genom-Editing. Nukleasen modifizieren das Genom an präzise definierten Stellen und eignen sich vor allem für Gen-Knockouts. Sie können auch für Gen-Insertionen verwendet werden, sind hierbei aber relativ ineffizient. Integrierende Vektoren hingegen können DNA sehr effizient in Zielgenome integrieren; dies geschieht allerdings an zufälligen Stellen im Genom, was im Kontext der Gentherapie problematisch ist, da es zu Dysregulation und Entartung der modifizierten Zellen führen kann. Daher besteht ein großer Bedarf an neuen Systemen, die die Vorteile beider Technologien zu kombinieren. Der Hauptteil dieser Dissertation beschreibt den Versuch, einen solchen steuerbaren integrierenden Vektor zu entwickeln. Der integrierende Vektor, der in dieser Arbeit benutzt wurde, ist das Sleeping Beauty (SB) Transposon, ein Transposonvektor, der sich durch hohe Aktivität in vielen Zelltypen auszeichnet. Die verwendete Nukleasekomponente stammt aus dem CRISPR/Cas9-System, einem bakteriellen Enzym, das durch kurze RNA-Moleküle (gRNAs) gesteuert wird. Dies sollte bewirken, dass der neue Transposonvektor ebenfalls einfach über RNA gesteuert werden kann. Um einen Zieleffekt zu erzielen, wurde die Sleeping Beauty Transposase mit katalytisch inaktivem Cas9 (dCas9) fusioniert. Dies geschah mit der Absicht, die Transposase in die Nähe von gRNA-definierten genomischen Zielen zu bringen. Weiterhin wurden Adapterproteine entwickelt, die die Transposase nicht-kovalent an gRNA-definierte Zielstellen bringen sollten. Alle Komponenten der neu entwickelten Proteine wurden in enzymatischen Assays getestet und es wurden für fast alle Komponenten messbare Aktivitäten festgestellt. Daraufhin wurden die Zielkomponenten mit verschiedenen gRNAs getestet. In Kombination mit einer gRNA, die eine Sequenz aus dem repetitiven AluY-Element bindet, konnte ein leichter Zieleffekt festgestellt werden, der jedoch nur bei Benutzung der direkten Fusion aus dCas9 und SB-Transposase statistisch signifikant war. In diesem Fall waren Insertionen in Alu-Elementen etwa doppelt so häufig, wenn die entsprechende gRNA verwendet wurde. Anzielen von AluY mit einem Adapterprotein, führte zu einer statistisch nicht signifikanten Anreicherung. Anzielen von repetitiven L1-Elementen konnte ebenfalls keinen statistisch signifikanten Effekt bewirken. Die Analyse von Insertionen um L1-Elemente wurde durch die geringere Anzahl von Zielstellen erschwert. Mit gRNAs, die nur eine einzelne Zielstelle im Genom haben, konnte kein Zieleffekt erreicht werden. Dies gilt sowohl für das HPRT-Gen, als auch für drei weitere Ziele, die nach Rezeptivität für SB-Insertionen ausgewählt wurden. Auch die Kombination mit einer mutierten SB-Transposase konnte die Spezifizität nicht genügend erhöhen, um Insertionen an einen spezifischen Lokus im Genom zu steuern. Die Analyse der Insertionen zeigte allerdings, dass die Fusionstransposasen ein charakteristisches Insertionsprofil haben, unabhängig von der benutzen gRNA. Da die fehlende Anreicherung von Insertionen in der Nähe der Zielsequenzen vermutlich vor allem auf die hohe Anzahl an Hintergrundinsertionen zurückzuführen ist, wurde eine neue SB-Mutante entwickelt, deren Aktivität zum Teil von der Präsenz einer fusionierten dCas9-Domäne und einer gRNA abhängt. Die Aktivität der Mutante SB(C42), als Fusion mit dCas9, konnte durch die Präsenz einer gRNA gegen das AluY-Element verdoppelt werden. Ob dies, wie erwartet, zu einem verbesserten Zieleffekt führt, konnte noch nicht endgültig geklärt werden. In einem Nebenprojekt dieser Dissertation wurde versucht, SB-Integrationen in ribosomale DNA zu steuern. Hierzu wurde die SB-Transposase mit einem nukleolaren Protein fusioniert. Dadurch wurde die Verteilung des Proteins in der Zelle beeinflusst; das Fusionsprotein ist in Nukleoli angereichert. Tatsächlich konnte durch diese Methode eine Erhöhung der Insertionsfrequenz in Nukleolusorganisatorregionen (NORs) und in Nukleolus-assoziierte Domänen (NADs) erreicht werden. In einem zweiten Nebenprojekt wurde versucht, das Verhältnis zwischen homology directed repair (HDR) und non-homologous end-joining (NHEJ) an Cas9-verursachten Doppelstrangbrüchen zu verbessern. Hierzu wurde Cas9 mit DNA-interagierenden Domänen fusioniert und entsprechende Bindesequenzen in die Donormoleküle eingebaut. Es konnte zwar eine Erhöhung des HDR/NHEJ-Verhältnisses mit den Fusionsproteinen festgestellt werden, dies war allerdings nicht abhängig von den Bindesequenzen im Donormolekül.