NMR-spektroskopische Untersuchungen an katalytischer RNA : ein Spleißosom basiertes lariatformendes Ribozym ; die Konformation der 2'-Hydroxylgruppe in RNA und deren Rolle in der Strukturstabilität

In Eukaryonten findet der Prozess des Spleißens im Spleißosom, einer sich permanent reorganisierenden, molekularen Maschine, statt. In diesem Prozess werden die kodierenden Sequenzen, die Exons, von den nicht kodierenden
In Eukaryonten findet der Prozess des Spleißens im Spleißosom, einer sich permanent reorganisierenden, molekularen Maschine, statt. In diesem Prozess werden die kodierenden Sequenzen, die Exons, von den nicht kodierenden Sequenzen, den Introns, getrennt und zusammengefügt. Durch die permanente Reorganisation des Spleißosoms war es bisher nicht möglich, die dreidimensionale Struktur der unterschiedlichen Komplexe in einer hohen Auflösung zu bestimmen. Tuschl et al. haben ein Ribozym entwickelt. Dieses bildet über den Angriff einer 2'-Hydroxylgruppe eines Adenosins auf das Phosphatrückgrat eines Guanosins ein Lariat. Diese Reaktion ist vergleichbar dem ersten Schritt der Spleißreaktion. In dieser Arbeit wurde das Ribozym vor der Ausbildung der Lariatstruktur charakterisiert. Eine Voraussetzung zur Strukturaufklärung mit NMR ist die Zuordnung der Resonanzen. Die Zuordnung zeigte, dass ein Teil der linearen Form des Ribozyms in zwei Konformationen vorliegt. Hier findet ein langsamer konformationeller Austausch statt, der die Resonanzüberlagerung erhöht und damit die Zuordnung der Signale erschwert. Aus diesem Grund wurden unterschiedliche Isotopen markierte Proben für die Zuordnung verwendet. Zur Verifizierung der Sekundärstruktur wurden neben NMR-Experimenten Mutationsstudien am Ribozym eingesetzt. Das Ribozym bildet zwischen g1-c12 und g17-c27 eine Helix. Die Helix weist neben kanonischen Basenpaarungen auch nicht kanonische Basenpaarungen auf. Die Adenosine am Anfang der Helix interagieren mit Nukleotiden in 3'-Position des branchpoint Adenosins. Dadurch befindet sich das branchpoint Adenosin a48 nahe dem g1. Zwischen diesen beiden Nukleotiden findet die Umesterung statt, in der das Lariat gebildet wird. Nach der Lariatbildung sind in den NMR Spektren nur noch die Resonanzen der kurzen Helices P1 und P2 zu beobachten. Die anderen Resonanzen unterliegen einem konformationellen Austausch. Die Struktur des Ribozyms verändert sich also nach der Lariatbildung beträchtlich. In der Spleißreaktion, aber auch in anderen katalytischen Prozessen besitzt die 2'-Hydroxylgruppe der RNA eine essentielle Funktion. Auch die wesentlichen strukturellen Unterschiede zwischen der RNA und DNA sind auf die 2'-Hydroxylgruppe zurückzuführen. Bislang liegen jedoch nur moleküldynamische Berechnungen und NMR-spektroskopische Untersuchungen an einzelnen Nukleotiden vor, die sich mit der Konformation der 2'-Hydroxylgruppe beschäftigen. In dieser Arbeit wurden erstmals die Konformationen der 2'-Hydroxylgruppen einer dreißig Nukleotide umfassenden RNA, der TAR-RNA, mit Hilfe von 3J-Kopplungen und NOEs bei niedrigen Temperaturen in Lösung ermittelt. Die Konformationsanalyse ergibt, dass die 2'-Hydroxylgruppen der unteren Helix der TAR-RNA in einem konformationellen Gleichgewicht zwischen der O3'- und der Basendomäne vorliegen. In beiden Orientierungen können sich die 2'-Hydroxylgruppen am Aufbau eines Netzwerks aus Wassermolekülen beteiligen, in dem zwei Wassermoleküle die große Furche der RNA Helix überspannen. Durch den Wechsel der 2'-Hydroxylgruppen zwischen der O3'- und Basen-Domäne unterliegt das Netzwerk einer stetigen Reorganisation.
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Eukaryotic splicing, whereby the coding exon sequences are separeted from the noncoding introns of pre-mRNA, is mediated through the spliceosome. Tuschl and coworkers designed a ribozyme which is based on the U2- und U6-
Eukaryotic splicing, whereby the coding exon sequences are separeted from the noncoding introns of pre-mRNA, is mediated through the spliceosome. Tuschl and coworkers designed a ribozyme which is based on the U2- und U6-snRNAs of the active complex of the spliceosome. As in the first step of splicing, it forms a lariat structure. In this transesterfication reaction a 2’-hydroxyl group of an adenosine attacks the phosphate backbone of a guanosine. The leaving group in the ribozyme is a pyrophosphate rather than the 5’-exon in the spliceosome. Due to the permanent reorganization of the spliceosome, the structure of the active complex is unknown. For this reason the lariat forming ribozyme can provide insight into the structural and functional features of the splicing reaction. Resonance Assignment is crucial for structure determination by NMR. Half of the linear ribozyme, including the short helix P2, is subject to a conformational exchange on a millisecond timescale. The exchange impedes the assignment because these nucleotides exhibit two different sets of resonances leading to resonance overlap. For the investiagtion of the lariat forming ribozyme a number of samples with differential isotopic labelling together with NMR experiments based on the NOE with filtering and editing techniques were found to be most suitable. The linear ribozyme forms a helix between nucleotides g1-c12 and g17-c27 as shown by NMR experiments and mutational studies. In this helix, canonical as well as non-canonical basepairs are included. Nucleotide g49, next to the branchpoint adenosine a48, is in close proximity to guanosine g1. This juxtaposes the 2’-hydroxy group of a48 next to the triphosphate at the 5’-end of the ribozyme and allows the transesterfication reaction. After lariat formation, the NMR spectra only show the resonances of the short helices P1 and P2. The other resonances are subject to a conformational exchange in the micro- to millisecond timescale. Upon lariat formation various structural changes occur within the ribozyme. The 2’-hydroxyl group of RNA plays an important role in, not only splicing, but numerous other catalytic processes. It is also responsible for the structural and functional differences between RNA and DNA. The conformation of this functional group has only been studied by molecular dynamic simulations and NMR of single nucleotides. In this work a conformational analysis of the 2’-hydroxyl group for the 30-mer HIV-2 transactivation response element (TAR) RNA was performed with 3J-couplings and NOEs at low temperature in solution. The analysis shows that the 2’-hydroxyl groups of the lower stem are in conformational exchange between the O3’ domain and the base domain. The 2’-hydroxyl proton interacts electrostatically in the O3’ domain wih the oxygen atom of the phosphate backbone, in the base domain with the O2 or N3 atom. The 2’-hydroxyl groups of paired nucleotides adopt two conformations. In the first, both groups are within the base domain. In the second one group shift to the O3’ domain. In both situations it enables a water network to form within the minor groove.
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Metadaten
Author:Jörg Fohrer
URN:urn:nbn:de:hebis:30-56362
Referee:Christian Griesinger
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2008/07/04
Year of first Publication:2007
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2008/05/05
Release Date:2008/07/04
HeBIS PPN:201678446
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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