Production, biochemical characterization and preliminary structural studies of human Endothelin B receptor in its ligand-bound state

G-protein coupled receptors (GPCRs) comprise the largest superfamily of cell surface receptors and possess a signature motif of seven transmembrane helices. The endothelin B (ETB) receptor is a member of rhodopsin like G
G-protein coupled receptors (GPCRs) comprise the largest superfamily of cell surface receptors and possess a signature motif of seven transmembrane helices. The endothelin B (ETB) receptor is a member of rhodopsin like GPCR family. It plays an important role in vasodilation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. Knowledge of the three-dimensional structure of G-protein coupled receptors in general would significantly add to our understanding of their molecular mechanisms and would be useful in the search for new specific drugs. However, three-dimensional structural analysis will require milligram quantities of pure and homogeneous protein. This dissertation is a study of the production, biochemical characterization and preliminary structural studies of the human ETB G-protein coupled receptor. The present work aimed at elucidating the structure and mechanistic details of function of the receptor by using a combination of X-ray crystallographic and NMR methods for collecting structural data. To obtain homogenous and monodisperse receptor protein preparation for structural and functional studies, we implemented the baculovirus expression system for the production of ETB receptor for the present work. The two step affinity purification ensured capture of full-length receptor. Silver stained SDS-PAGE of the purified receptor-ligand complex indicated greater than 90% protein purity. Based on previous reports, we used the high affinity ligand (endothelin -1) binding to the receptor for co-crystallization of receptor-ligand complex by locking the receptor in the activated conformation. As a prerequisite for 3D crystallization trials, the stability of the detergent solubilized receptor-ligand complex was assessed with respect to pH, temperature and time. Receptor-ligand complex did not show any degradation and aggregation over 6 days at 4°C and 18°C. Interestingly, change of pH suggested that receptor-ligand complex is unstable at lower pH due to possible charge induced conformational changes. In our work, we introduced the idea of using fluorophore labeled ligand for simple visual recognition of the receptor-ligand complex during purification and crystallization. On the other hand, we alternatively used biotinylated endothelin-1 to produce an adequate amount of ligand bound receptor complex, thus ensuring homogeneity of the purified complex for use in structural studies. Thus far, preliminary crystals have been obtained for both the unlabelled ET-1 and fluorophore labeled ET-1 complexed with ETB receptor. Moreover, we performed the systematic investigation of the protein/peptide binding partner for the receptor-ligand complex with the chief aims of stabilizing structure and increasing the possibilities of 3D-crystal contacts. Thus subsequent to formation of receptor-ligand complex, the additional in vitro formation of a ternary arrestin-receptor-ligand complex was also attempted for use in structural studies. We successfully demonstrated that arrestin mutant (R169E) forms a tight complex with ETB receptor regardless of its phosphorylation state. A second approach to get insight into the ETB receptor ligand binding site relied on the use of spin isotope labeled ET-1 ligand peptide by employing solid state MAS NMR method. Preliminary data provided compelling evidence that the C-terminal region of the peptide is immobilized in an ordered environment and presumably bound to the receptor. This indicates that the approach is feasible, although there are difficulties in sample preparation for further spectral measurements and data collection which are currently being discussed in ongoing investigations. At this point of our research work, we initiated a collaborative effort to obtain high yields of pure, active receptor without post translational modifications, from an E. coli cell lysate based in vitro expression system. We successfully optimized the production of homogenous and monodisperse endothelin B receptor in mg amounts. Thus this could potentially provide an alternative source of high quality receptor production in large quantities for immediate crystallization trials. Thus we hope that the results from these investigations can be applied in a more general sense to the production and crystallization of other G protein-coupled receptors.
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Eine der Hauptursachen für die begrenzte Anzahl von Membranproteinen mit bekannter Raumstruktur sind die sehr geringen Mengen an verfügbarem funktionell aktivem Protein. Der Grund dafür ist, dass in der Regel Membranprot
Eine der Hauptursachen für die begrenzte Anzahl von Membranproteinen mit bekannter Raumstruktur sind die sehr geringen Mengen an verfügbarem funktionell aktivem Protein. Der Grund dafür ist, dass in der Regel Membranproteine nicht in ausreichenden Mengen aus natürlichen Quellen für pharmakologische, biochemische und strukturelle Untersuchungen isoliert werden können. Eine heterologe Expression ist daher unerlässlich, was insbesonders für eukaryontische Membranproteine immer noch eine große Herausforderung darstellt. G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Familie der Rezeptoren dar und sind von überragender Bedeutung bei der Kommunikation der Zelle mit der äußeren Umgebung. Sie zeichnen sich durch sieben Transmembranhelizes als gemeinsames Strukturmerkmal aus. Der Endothelin B Rezeptor ist ein Mitglied der Rhodopsin-Familie und hat eine Schlüsselrolle in einer Reihe von essentiellen Lebensvorgängen. Er wird z.B. in den Endothelzellen gefunden und ist dort für die Erweiterung der Blutgefäße verantwortlich. Störungen dieser Prozesse führen zu Krankheiten, was die pharmakologische Bedeutung und das große Interesse an einer Struktur dieses Rezeptors erklärt. Das Hauptprojekt der vorliegenden Dissertation war die Produktion, Charakterisierung und Strukturanalyse des Endothelin B Rezeptors in seinem Liganden gebundenen Zustand. Dabei ging es vor allem darum, die strukturellen und funktionellen Details des Rezeptors zu verstehen. Für die Strukturanalyse wurde eine Kombination aus Röntgenkristallografie und Kernresonanzspektroskopie eingesetzt. Um eine hochauflösende Struktur zu erhalten, ist eine hohe Qualität des zu untersuchenden Proteins unumgänglich. Daher wurde die Stabilität des Proteins unter verschiedenen Bedingungen analysiert. Die ersten Ansätze der 3D-Kristallisation wurden mit dem Rezeptor-Liganden-Komplex durchgeführt, um den Rezeptor in einer definierten, aktiven Konformation zu arretieren. Vorangegangene Studien in unserem Labor deuten darauf hin, dass die Qualität des rekombinanten EndothelinB-Rezeptors aus dem Pichia pastoris Expressionssystem nicht ausreicht, um damit Kristallisationsexperimente durchzuführen. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit ein alternatives Expressionssystem getestet. Hierbei erfolgte die Produktion des EndothelinB-Rezeptors mit Hilfe eines Baculovirus-Expressionssystems, wobei die Insektenzelllinie Spodoptera frugiperda (Sf9) verwendet wurde. Das Virus mit dem durch homologe Rekombination eingebauten Expressionskonstrukt war von Helmut Reiländer erstellt worden. Bindungsstudien mit Hilfe eines radioaktiven Liganden nach Aufschluss der Insektenzellen zeigten ein Maximum der Rezeptormenge 66 Stunden nach der Virusinfektion. Der Ligandenbindungstest mit 125I [ET-1] ergab eine spezifische, sättigbare Bindung des Liganden mit einer Dissoziationskonstante von 53±6 pM. Die maximale Expressionsausbeute lag bei 51±10 pmol/mg Membranprotein, was etwa einem Wert von 0.34 mg Rezeptor pro Liter Kulturmedium entspricht. Eine Untersuchung des oligomeren Zustands des rekombinanten Proteins mittels blauer nativer Gelelektrophorese deutet auf einen dimeren Zustand des gereinigten Rezeptors hin. Durch die Einführung eines fluoreszenzmarkierten Liganden (Endothelin-1) war es bei vielen Experimenten möglich, auf die kostenintensive Verwendung von radioaktiven Substanzen zu verzichten. Neben einer einfachen Quantifizierung durch spektroskopische Methoden liegt ein weiterer Vorteil darin, den farblichen Rezeptor-Liganden-Komplex während der Reinigung und Kristallisation sehr einfach detektieren zu können. Der EndothelinB -Rezeptor wurde aus den Sf9-Zellmembranen mit Hilfe von n-Dodecyl-β-D-Maltopyranosid ohne Ligand oder in Gegenwart des endogenen Liganden Endothelin-1 bzw. des fluoreszenzmarkierten Endothelin-1 solubilisiert. Das anschließende zweistufige Reinigungsverfahren bestand aus einer Metallaffinitätschromatographie, basierend auf sechs N-terminal an den EndothelinB-Rezeptor angehängten Histidinresten und einer nachfolgenden Avidinaffinitätschromatographie, die auf einer C-terminal fusionierten Biotinylierungsdomäne beruhte. Eine Polyacrylamidgelelektrophorese mit anschließender Silberfärbung ergab, dass der EndothelinB-Rezeptor zu 90% - 95% rein war. Pro Präparation, die etwa eine Woche dauert, konnte somit etwa 0.5 mg EndothelinB-Rezeptor isoliert werden. Die maximal erreichbare Konzentration des Rezeptors liegt bei über 70 mg/ml. Bindungsstudien an dem ohne Ligand solubilisierten und gereinigten EndothelinB-Rezeptor zeigten, dass dieser fluoreszenzmarkiertes Endothelin-1 binden kann und somit korrekt gefaltet und funktionell aktiv ist. Weitere Solubilisierungsversuche mit verschiedenen Detergenzien ergaben, dass der EndothelinB-Rezeptor in einer Reihe nichtionischer Detergenzien stabil war, d.h. homogen und zur Bindung von Endothelin-1 fähig war. In ionischen Detergenzien aggregierte der Rezeptor jedoch rasch und verlor die Bindungsfähigkeit für Endothelin-1. 3D-Kristallisationsuntersuchungen an einem Membranprotein verlangen vorab eine gründliche Charakterisierung des Proteins bezüglich Homogenität und Stabilität. Daher wurde das Aggregations- und Degradationsverhalten des EndothelinB-Rezeptors und des fluoreszenzmarkierten Endothelin1-Rezeptor-Komplexes in Abhängigkeit von der Zeit, der Temperatur, dem pH-Wert und verschiedenen Detergentien mit Hilfe der analytischen Gelfiltrationschromatographie und der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese untersucht. Demnach bleibt der Komplex etwa eine Woche bei 4°C und 18°C sowie in einem pH-Bereich von 6 – 8 intakt und homogen. Die Instabilität des Rezeptor-Liganden-Komplexes bei niedrigem pH lässt auf eine ladungsinduzierte Konformationsänderung des Rezeptors schließen. Neben dem Liganden als Bindungspartner wurde untersucht, ob eine in vitro Bindung des korrespondierenden G-Proteins (Gi) möglich ist. Ein stabiler Komplex aus Rezeptor, G-Protein und Agonist könnte sich zum einen stabilisierend auf den Rezeptor auswirken und zum anderen weitere hydrophile Flächen für mögliche Kristallkontakte bereitstellen. Zum gleichen Zweck wurde die Möglichkeit untersucht, Arrestin als Bindungspartner zu dem ligandengebundenen Rezeptor zu verwenden. Hierfür kam eine Arrestin-Mutante (R169E) zum Einsatz, welche unabhängig vom Phosphorylierungsstatus des Rezeptors an dessen C-Terminus binden soll. Leider zeigte sich in beiden Fällen, dass weder eine Bindung zu Arrestin noch eine Bindung zu dem G-Protein möglich war. Aus der Analyse des gereinigten Proteins wird deutlich, dass sich der EndothelinB-Rezeptor-Endothelin-1-Komplex für eine erfolgreiche 3D-Kristallisation eignet. Dies ist deswegen von großer Bedeutung, da nur etwa einer von 100 untersuchten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren Erfolg versprechende Voraussetzungen mitbringt. Dieses erfreuliche Ergebnis steht im Gegensatz zu früheren Berichten, wo der in Pichia pastoris exprimierte EndothelinB-Rezeptor als unbrauchbar für eine 3D-Kristallisation eingeschätzt wurde. Damals lag der Rezeptor überwiegend in einer aggregierten Form vor, die nur teilweise durch Solubilisierung mit dem Liganden (Endothelin-1) zurückgedrängt werden konnte. Offenbar beeinflusst die unterschiedliche zelluläre Maschinerie und die unterschiedliche Membranzusammensetzung von Insekten- und Hefezellen das Expressions- und damit das Aggregationsverhalten deutlich. Der gereinigte ETB-Rezeptor wurde vor der Kristallisation auf etwa 5mg/ml oder 10 mg/ml aufkonzentriert. Kristallisationsansätze wurden mit 11 Detergenzien verschiedenen Typs (n-Alkyl-β-D-Maltosid, Alkyl-β-D-Glukosid, Alkylphoscholin, Cymal-n, N-Alkyl-N,N-dimethylamin-N-oxid, Polyoxyethylenalkylether) durchgeführt, wobei Dodecyl-Maltosid beim ersten Reinigungsschritt während der Bindung an die Ni-NTA-Säule durch die genannten Detergenzien ersetzt wurde. 3D-Kristallisationsversuche des Rezeptor-Endothelin-1 bzw. Rezeptor-fluoreszenzmarkierten-Endothelin-1-Komplexes wurden mit der Methode des „hängenden und sitzenden Tropfens“ mit Hilfe engmaschiger Screeningstrategien durchgeführt. Mehrere Bedingungen führten zu Proteinkristallen, was aufgrund der fluoreszierenden Eigenschaften der Kristalle des Komplexes nachgewiesen werden konnte. Leider waren die Kristalle nicht reproduzierbar und eine nähere Charakterisierung sowie eine Verbesserung der Kristallisationsbedingungen war daher nicht möglich. Wir vermuteten, dass die fehlende Reproduzierbarkeit auf eine Mischpopulation von Rezeptor mit und ohne Ligand zurückzuführen war. Als Ausweg erschien, biotinyliertes Endothelin-1 an eine Avidinsäule zu binden, um damit spezifisch funktionell aktiven Endothelin Rezeptor aus dem Eluat herauszufischen (Die Bindungsaffinität zwischen EndothelinB-Rezeptor und ET-1 liegt im picomolaren Bereich.) Um dieses Ziel zu erreichen, musste jedoch die Biotinylierungsdomäne aus dem Konstrukt pVLMelFlagHisΔGPETBBio entfernt werden. Sie wurde durch eine Stab-Domäne ersetzt, weil sie strukturell verwandt zur Biotinylierungsdomäne ist (ohne Avidin zu binden) und häufig die Expressionsmenge des Proteins erhöht. Die Expression des ETB-Rezeptors mit diesem Konstrukt war jedoch mit 10 pmol/mg viel zu gering, um damit die angestrebten Experimemte durchführen zu können. Um die Wechselwirkungen zwischen dem EndothelinB-Rezeptor und seinem Liganden ET-1 zu charakterisieren, wurde parallel zur 3D-Kristallisation mit einer Festkörper-NMR-Untersuchung begonnen. Vorläufige Ergebnisse bestätigten bereits, dass der mit den Isotopen 13C und 15N markierte Ligand an den Rezeptor bindet und in der Zukunft detailierte Informationen über die Bindung des Liganden aufgrund der Homogenität und der hohen Löslichkeit realistisch sind. Eine erste Analyse der NMR-Daten deutet darauf hin, dass dieser Ansatz Erfolg versprechend ist, obwohl einige Schwierigkeiten bei der Probenvorbereitung und bei der Sammlung und Auswertung der Daten auftraten. Eine zellfreie Expression des ETB-Rezeptors in E.coli-Extrakt stellt eine vielversprechende Methode dar, den Rezeptor (verglichen mit anderen Methoden) schnell und mit hoher Ausbeute zu produzieren. Die Expression und Reinigung wurde von Christian Klammt (Abteilung Biophysikalische Chemie, Universität Frankfurt) durchgeführt. Die Qualität des ETB-Rezeptors bezüglich seiner Homogenität und seiner Cy3-ET-1 – Bindungsfähigkeit wurde von uns mittels Gelfiltrationschromatographie überprüft. Es ergab sich, dass die Expression in Gegenwart eines Detergenz deutlich besser verläuft als eine Expression ohne Detergenz mit nachfolgender Resolubilisierung des entstandenen Niederschlags. Es wurden insgesamt 11 Detergenzien getestet, um die Aggregation zu minimieren und die Bindungsfähigkeit an den Liganden zu maximieren. Dabei erwiesen sich die Detergenzien der Brij-Klasse als am geeignetsten, besonders Brij78, das schließlich zur Rezeptorproduktion in-vitro ausgewählt wurde. Die Bindung des Rezeptors an biotinyliertes ET-1 erlaubte nach der Ni-NTA–Chromatographie einen zusätzlichen Reinigungsschritt über monomeres Avidin. Eine Polyacrylamidgelelektrophorese mit anschließender Silberfärbung ergab, dass der EndothelinB-Rezeptor nun bis zu 80% bis 90% rein war. Die Ausbeute lag bei etwa 1 mg/ml E.coli-Extrakt und erste Kristallisationsversuche konnten daher unternommen werden. Diese ermutigenden Ergebnisse zeigen, dass bei weiterer Optimierung des Versuchsablaufs, das zellfreie Expressionsystem in der Lage sein kann, funktionell aktiven ETB-Rezeptor in größeren Mengen zu produzieren. Ein Vergleich der Rezeptorproduktion in den Expressionssystemen Pichia pastoris, Insektenzellen und in vitro ergab signifikante Unterschiede in Bezug auf Quantität und Qualität des erhaltenen Rezeptors. So hat das Pichia-System zwar prinzipiell das Potential ausreichende Mengen für Kristallisationsversuche zu produzieren, jedoch zeigt der Rezeptor nach der Reinigung eine Mischung aus monomerem und aggregiertem Protein. Möglicherweise spielt hier eine unterschiedliche Verteilung in verschiedenen Zell-Kompartimenten eine wichtige Rolle für das partielle Aggregationsverhalten des Rezeptors. Der Rezeptor aus Sf9-Zellen dagegen wird zwar in geringeren Mengen produziert, zeigte jedoch eine so hohe Homogenität auch in Bezug auf das Ligandenbindungsverhalten, dass hier eine Kristallisation möglich war. Eine weitere Verbesserung des in vitro-Systems wäre von hohem Wert, da hier die Vorteile einer kurzen Produktionsdauer mit einer hohen Ausbeute kombiniert werden. Dadurch können kurzfristig Änderungen (z.B. an der Sequenz) vorgenommen werden, die bei den beiden anderen Systemen Wochen oder Monate dauern würden. So können letztendlich die intrinsischen Eigenschaften jedes einzelnen Systems (z.B. verschiedene Lipide) für den Erfolg oder Misserfolg der Kristallisationsversuche verantwortlich sein. Wir hoffen, dass die hier gewonnenen Erkenntnisse auch auf andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren übertragbar sind, um diese dann strukturell untersuchen zu können.
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Metadaten
Author:Ankita Srivastava
URN:urn:nbn:de:hebis:30-48721
Referee:Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2007/09/21
Year of first Publication:2007
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2007/08/22
Release Date:2007/09/21
Note:
Diese Dissertation steht leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext im WWW zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS PPN:19059862X
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität; nur lokal zugänglich)
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG

$Rev: 11761 $