NMR, EM and functional studies on TBsmr, a small multidrug transporter from M. tuberculosis

Antibiotic resistance of pathogenic bacteria is a major worldwide problem. Bacteria can resist antibiotics by active efflux due to multidrug efflux pumps. The focus of this study has been the mycobacterial multidrug tran
Antibiotic resistance of pathogenic bacteria is a major worldwide problem. Bacteria can resist antibiotics by active efflux due to multidrug efflux pumps. The focus of this study has been the mycobacterial multidrug transporter TBsmr because it belongs to the small multidrug resistance (SMR) family whose members are a paradigm to study multidrug efflux due to their small size. SMR proteins are typically 11-12 kDa in size and have a four-transmembrane helix topology. They bind cationic, lipophilic antibiotics such as ethidium bromide (EtBr) and TPP+, and transport them across the membrane in exchange for protons. To understand the molecular mechanism of multidrug resistance, we have to gain information about the structure and function of these proteins. The research described in this thesis aimed to deduce details about the topology, transport cycle and key residues of TBsmr using biophysical techniques. Solid-state NMR (ssNMR) can provide detailed insight into structural organization and dynamical properties of these systems. However, a major bottleneck is the preparation of mg amounts of isotope labeled protein. In case of proteoliposomes, the problem is compounded by the presence of lipids which have to fit into the small active volume of the ssNMR rotor. In Chapter 3, an enhanced protein preparation is described which yields large amounts of TBsmr reconstituted in a native lipid environment suitable for further functional and structual studies. The achieved high protein-to-lipid ratios made a further characterization by ssNMR feasible. The transport activity and oligomeric state of the reconstituted protein in different types of lipid was studied as shown in Chapter 4. The exact oligomeric state of native SMR proteins is still uncertain but a number of biochemical and biophysical studies in detergent suggest that the minimal functional unit capable of binding substrate is a dimer. However, binding assays are not ideal since a protein may bind substrate without completing the transport cycle which can only be shown for reconstituted protein in transport assays.By combining functional data of a TPP+ transport assay with information about theoligomeric state of reconstituted TBsmr obtained by freeze-fracture electron microscopy, it could be shown that lipids affect the function and the oligomeric state of the protein, and that the TBsmr dimer is the minimal functional unit necessary for transport. The transport cycle must involve various conformational states of the protein needed for substrate binding, translocation and release. A fluorescent substrate will therefore experience a significant change of environment while being transported, which influences its fluorescence properties. Thus the substrate itself can report intermediate states that form during the transport cycle. In Chapter 5, the existence of such a substrate-transporter complex for the TBsmr and its substrate EtBr could be shown. The pH gradient needed for antiport has been generated by co-reconstituting TBsmr with bacteriorhodopsin. The measurements have shown the formation of a pH-dependant, transient substrate-protein complex between binding and release of EtBr. This state was further characterized by determining the Kd, by inhibiting EtBr transport through titration with non-fluorescent substrate and by fluorescence anisotropy measurements. The findings support a model with a single occluded intermediate state in which the substrate is highly immobile. Liquid-state NMR is a useful tool to monitor protein-ligand interactions by chemical shift mapping and thus identify and characterize important residues in the protein which are involved in substrate binding. In agreement with previous studies (Krueger-Koplin et al., 2004), the detergent LPPG was found to be highly suitable for liquid-state NMR studies of the membrane protein TBsmr and 42% of the residues could be assigned, as reported in Chapter 6. However, no specific interactions with EtBr were found. This observation was confirmed by LILBID mass spectrometry which showed that TBsmr was predominantly in the non-functional monomeric state. Functional protein was prepared in proteoliposomes which can be investigated by solidstate NMR (Chapter 7). Besides the essential E13, the aromatic residues W63, Y40, and Y60 have been shown to be directly involved in drug binding and transport. Different isotope labeling strategies were evaluated to improve the quality of the NMR spectra to identify and characterize these key residues. In a single tryptophan mutant of reconstituted TBsmr W30A, the binding of ethidium bromide could be detected by 13C solid-state NMR. The measurements have revealed two populations of the conserved W63 residue with distinct backbone structures in the presence of substrate. There is a controversy about the parallel or anti-parallel arrangement of the protomers in the EmrE dimer (Schuldiner, 2007) but this structural asymmetry is consistent with both a parallel and anti-parallel topology.
show moreshow less
Die Antibiotikaresistenz pathogener Bakterien ist ein Problem für die Gesundheit von Menschen weltweit und damit ein wichtiges Forschungsziel. Ein Mechanismus zur Resistenz gegen Antibiotika ist der aktive Transport von 
Die Antibiotikaresistenz pathogener Bakterien ist ein Problem für die Gesundheit von Menschen weltweit und damit ein wichtiges Forschungsziel. Ein Mechanismus zur Resistenz gegen Antibiotika ist der aktive Transport von Antibiotika aus der Zelle heraus durch so genannte Multidrug-Transportproteine. Zusätzlich sind diese Transporter als Modellsysteme auch von großem generellem Interesse, denn ihre erstaunliche Fähigkeit, eine Vielzahl sehr diverser Wirkstoffe spezifisch zu binden, scheint den verbreiteten Ansichten über Substrat-Protein-Wechselwirkung zu widersprechen. Zur Untersuchung des Multidrug-Transports befasst sich die vorliegende Arbeit mit der SMR-Familie (small multidrug resistance), deren Mitglieder sich auf Grund ihrer kleinen Größe hervorragend als Modellsysteme eignen. Die SMR-Proteine sind typischerweise 11-12 kDa schwer und bestehen aus vier transmembranen ? - Helizes. Sie transportiere eine Reihe unterschiedlicher aromatischer und positiv geladener Substrate wie zum Beispiel Ethidium Bromid im Austausch gegen Protonen durch die Membran. Um offene strukturelle und mechanistische Fragen zu beantworten, wurde TBsmr von M. tuberculosis, als ein typisches SMR Protein, ausgewählt. Ziel dieser Arbeit war es, ein besseres Verständnis von der Oligomerisierung, dem Transportzyklus und wichtigen, konservierten Aminosäuren der SMR-Familie durch Untersuchungen mit biophysikalischen Methoden zu bekommen. Die Festkörper-NMR-Spektroskopie eignet sich, um Informationen über die Struktur und Dynamik dieser Systeme zu erhalten. Vorteilhaft sind Messungen an Proteoliposomen, da sich das Protein dann in seiner nativen Membranumgebung befindet. Die Notwendigkeit von mg-Mengen isotopenmarkierter Proteine ist aber ein großer Engpass bei der Umsetzung. Der Nachteil dieser Proben ist darüber hinaus das zusätzliche Volumen durch Lipide, da die Festkörper-NMR-Rotoren nur ein geringes Probenvolumen fassen. Durch eine verbesserte Probenpräparation ließen sich große Mengen isotopenmarkiertes TBsmr gewinnen und mit einem hohen Protein-zu-Lipid Verhältnis in Liposomen rekonstituieren. Diese Verbesserungen ermöglichten die nachfolgenden Messungen zur Charakterisierung von TBsmr. Der Oligomerisierungszustand der nativen SMR-Proteine ist noch nicht sicher bestimmt, aber die meisten biochemischen und biophysikalischen Untersuchungen in Detergenz deuten darauf hin, dass ein Dimer die minimale funktionelle Einheit ist, die Substrat binden kann. Ligand-Bindungs-Experimente haben aber den Nachteil, dass eventuell Substrat an das Protein bindet, es aber trotzdem nicht transportiert werden kann. Daher wurde der Transport des Substrats Tetraphenylphosphonium (TPP+) in verschiedenen Lipiden untersucht. Die Messungen erfolgten mit Hilfe von pH-Sprüngen und einer TPP+ -sensitiven Elektrode. Dabei wurde ein Einfluss der Lipidsorte auf die Aktivität und den Oligomerisierungszustand von TBsmr festgestellt. Durch Kombination mit Informationen über den Oligomerisierungsgrad des rekonstitutierten Proteins aus Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie-Untersuchungen, konnte die Existenz von funktionalen Dimeren, die Substrat transportieren, in POPC nachgewiesen werden. In Übereinstimmung mit bisherigen Untersuchungen, die auf die Existenz höherer Oligomere hindeuten, wurden in E. coli Lipiden Tetramere gefunden. Der Transportzyklus muss eine Reihe von verschiedenen Konformationen für die Bindung, den Transport und die Freisetzung des Substrats enthalten. Eine fluoreszierende Substanz wird sich beim Transport durch die starken Änderungen der Umgebung in ihren Fluoreszenzeigenschaften verändern. Deshalb könnte das Substrat selbst als Reporter für Zwischenzustände im Transportzyklus benutzt werden. Es konnte die Existenz eines solchen Substrat-Transporter-Komplexes für TBsmr und das Substrat Ethidium Bromid mit einem neu entwickelten Assay nachgewiesen werden. Die Möglichkeit eines stabilen pH-Gradienten wurde durch die Korekonstitution von TBsmr mit Bakteriorhodopsin geschaffen. Die beobachtete Fluoreszenzänderung wurde durch einen pH-abhängigen, transienten Substrat-Protein-Komplex zwischen der Bindung und der Freisetzung von Ethidium verursacht. Zusätzlich wurde dieser Zustand durch die Bestimmung eines Kds, der Hemmung des Ethidiumtransports durch die Titration mit einem nicht fluoreszierenden Substrat und durch Fluoreszenzanisotropie-Messungen genauer charakterisiert. Die Ergebnisse deuten auf einen einzelnen verdeckten Übergangszustand hin, in dem das Substrat unbeweglich ist. Lösungs-NMR-Experimente wurden durchgeführt, um zu evaluieren, ob Substrat-Protein-Interaktionen gemessen werden können. Dabei eignete sich besonders das Detergenz LPPG und es war möglich, 42 Prozent aller Resonanzen des Protein-Rückgrates vorläufig zuzuordnen. Es konnten aber keine spezifische Interaktion von TBsmr mit Ethidium Bromid nachgewiesen werden. Die Beobachtungen wurden durch LILBID-Massenspektrometrie-Messungen (Laser Induced Liquid Beam Ionization/Desorption) unterstützt, welche nicht-funktionale TBsmr Monomere in LPPG nachwiesen. Das Problem einer funktionalen Präparation ließ sich durch Aktivität in Lipidmembranen lösen, wo Membranproteine sehr gut mittels Festkörper-NMR untersucht werden können. Neben dem essentiellen Glutamat 13 sind einige weitere, aromatische Aminosäuren (Y40, Y60, W63) für den Transportzyklus wichtig. Es wurden Festkörper-NMR-Messungen an vollständig und selektiv markierten Proben durchgeführt, um durch verschiedene Isotopenmarkierungs-Schemata die Qualität der NMR-Spektren soweit zu verbessern, dass einzelne Aminosäuren identifiziert und charakterisiert werden können. Mit der Mutante TBsmr W30A, in der ein einzelnes Tryptophan vollständig mit 13C Isotopen markiert war, konnte die Bindung von Ethidium Bromid detektiert werden. Die Messungen offenbarten zwei Populationen der konservierten Aminosäure W63 mit verschiedenen Konformationen des Peptidrückgrats in Gegenwart von Substrat. Die beobachtete strukturelle Asymmetrie von W63 ist sowohl in einer parallelen, wie auch anti-parallelen Topologie der Dimere möglich.
show moreshow less

Download full text files

Export metadata

  • Export Bibtex
  • Export RIS

Additional Services

    Share in Twitter Search Google Scholar
Metadaten
Author:Daniel Basting
URN:urn:nbn:de:hebis:30-57102
Referee:Clemens Glaubitz
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2008/08/13
Year of first Publication:2008
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2008/06/02
Release Date:2008/08/13
HeBIS PPN:202930483
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $