Intramolekulares Interaktionsinterface des MLL Proteins als therapeutisches Target der Translokation t(4;11)

Intramolecular interaction domains of the MLL protein as therapeutic target for the translocation t(4;11)

Chromosomale Aberrationen des humanen MLL Gens (Mixed Lineage Leukemia) sind mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert. 5-10% aller akuten myeloischen und lymphatischen Leukämien beruhen auf einer Translokation 
Chromosomale Aberrationen des humanen MLL Gens (Mixed Lineage Leukemia) sind mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert. 5-10% aller akuten myeloischen und lymphatischen Leukämien beruhen auf einer Translokation des MLL Gens mit einem von mehr als 50 bekannten Partnergenen. Die reziproke Translokation t(4;11), die zur Entstehung der zwei Fusionsgene MLL/AF4 und AF4/MLL führt, stellt die häufigste genetische Veränderung des MLL Gens dar und prägt sich in Form einer akuten lymphatischen Leukämie aus. Besonders häufig sind von dieser Erkrankung Kleinkinder und Patienten mit einer Sekundärleukämie betroffen. Aufgrund einer ungewöhnlich hohen Resistenz der leukämischen Blasten gegenüber gängigen Therapie-Protokollen ist diese Erkrankung mit einer schlechten Prognose verbunden. Die beiden erzeugten Fusionsgene der t(4;11) werden als Fusionsproteine MLL/AF4 (der11) und AF4/MLL (der4) exprimiert. Transduktionsexperimente verschiedener MLL Translokationen zeigten, dass in vielen Fällen das jeweilige der11 Fusionsprotein (MLL_N/Translokationspartner) starkes onkogenes Potential besitzt und daher vermutlich ursächlich für die Transformation der betroffenen Zellen ist. Im Fall der Translokation t(4;11) hingegen, konnte für das der11 Fusionsprotein MLL/AF4 nur sehr schwaches onkogenes Potential nachgewiesen werden, während das der4 AF4/MLL Fusionsprotein sich als potentes Onkoprotein herausstellte. Untersuchungen zur Aufklärung des pathologischen Mechanismus des AF4/MLL Fusionsproteins zeigten, dass es, analog zum MLL Wildtyp Protein, einer Prozessierung durch die Taspase 1 unterliegt. Desweiteren ist bekannt, dass die gebildeten Proteinfragmente, der4_N und der4_C (MLL_C), über intramolekulare Interaktionsdomänen des MLL Proteins, in der Lage sind miteinander zu komplexieren. In der unprozessierten Form wird das Fusionsprotein über einen Bereich des AF4 Proteins unter Einsatz der E3-Ligasen SIAH 1/2 dem proteasomalen Abbau zugeführt. Nach der Proteolyse und Komplexbildung findet weiterhin eine Erkennung durch die SIAH Proteine statt, jedoch erfolgt keine Degradation mehr. Auf diese Weise kommt es zur Akkumulation des Komplexes, was letztendlich zur Transformation der betroffenen Zellen führt. Eine Möglichkeit dem onkogenen Charakter des AF4/MLL Fusionsproteins entgegen zu wirken, besteht in der Inhibition der Interaktion der zwei Proteinfragmente der4_N und der4_C (=MLL_C). Für eine mögliche Inhibition stellt die Kenntnis der minimalen Kontaktdomäne des MLL Proteins (und damit gleichermaßen des AF4/MLL Proteins) eine Grundvoraussetzung dar. Die grundlegende Aufgabe der vorliegenden Arbeit bestand daher in der Bestimmung des minimalen intramolekularen Interaktionsinterface. Zu diesem Zweck wurden Interaktionsanalysen verschiedener C-terminaler und N-terminaler MLL Proteinfragmente unter Verwendung des bakteriellen Zwei-Hybrid-Systems sowie eines zellbasierten Protein-Translokation-Biosensor-Systems durchgeführt. Dabei ist es gelungen, die Größe der minimalen Interaktionsdomänen von den bis heute publizierten >150 Aminosäuren auf 58 Aminosäuren im N-terminalen Proteinfragment (FYRN_A3) bzw. 56 Aminosäuren im C-terminalen MLL Fragment (FYRC_B3) einzugrenzen. Eine weitere Verkleinerung führte zu einem Stabilitätsverlust der Interaktion. Eine ungewöhnliche Akkumulation einiger C-terminaler MLL Fragmente, die während der Interaktionsstudien beobachtet wurde, führte zu der Hypothese, dass die generierten Fragmente mit dem zellulären Wildtyp MLL interagieren und möglicherweise als Inhibitor der intramolekularen Interaktion agieren können. Zusätzlich wurde bei diesen Transfektionen eine abnorm hohe Anzahl abgestorbener Zellen festgestellt. Dies wäre damit zu erklären, dass das zelluläre MLL, durch Interaktion mit dem kleinen MLL Fragment, nicht mehr in der Lage ist, seinen natürlichen Funktionen nachzukommen. Der Nachweis der Interaktion des minimierten C-terminalen MLL Proteinfragments FYRC_B3 mit den full length Proteinen MLL sowie AF4/MLL konnte über Co-Immunopräzipitationsversuche erbracht werden. Durchflusscytometrische Analysen transfizierter und Propidiumiodid gefärbter HeLa Zellen sowie t(4;11)-positiver SEM Zellen zeigten eindeutig letale Effekte einiger FYRC-Fragmente auf. Anhand dieser Daten kann postuliert werden, dass die Fragmente FYRB_B3 und FYRC_B1 durch Interaktion mit MLL_N bzw. der4_N die Interaktion der nativen Proteinfragmente MLL_N/der4_N mit MLL_C verhindern und dies in der Folge zum Absterben der Zellen führt. Die Tatsache, dass diese Fragmente einen solch deutlichen Effekt auf die sehr therapieresistenten SEM Zellen haben, zeigt, dass die Inhibierung der intramolekularen Proteininteraktion einen vielversprechenden therapeutischen Ansatz für Leukämien mit einer Translokation t(4;11) darstellt.
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Chromosomal aberrations of the human MLL gene (Mixed lineage leukemia) are associated with the emergence of acute leukemias. 5 – 10% of all acute leukemias (myeloid or lymphoid) are based on a translocation of the MLL ge
Chromosomal aberrations of the human MLL gene (Mixed lineage leukemia) are associated with the emergence of acute leukemias. 5 – 10% of all acute leukemias (myeloid or lymphoid) are based on a translocation of the MLL gene with one of more than 50 known translocation partner genes. The chromosomal translocation t(4;11) with the resulting fusion genes AF4/MLL and MLL/AF4 is the most frequent genetic rearrangement of the human MLL gene leading to acute lymphoblastic leukemia. Due to an extraordinary resistance to common therapy protocols this disease is associated with an extremely poor prognosis. The two generated fusion genes are expressed as fusion proteins AF4/MLL (der4) and MLL/AF4 (der11). Whereas for some MLL translocations the der11 fusion protein (MLL/translocation partnerX) has been shown to exhibit oncogenic potential, the der4 protein of the translocation t(4;11) was able to lead to an oncogenic transformation of cells. Experiments to clarify the underlying pathological mechanism have shown the cleavage of the AF4/MLL fusion protein by Taspase 1, analogue to the processing of the wildtype MLL protein, followed by a heterodimerisation of the generated protein fragments and the subsequent assembly of a multiprotein complex. Whilst the unprocessed fusion protein is recognised by the E3 ligases SIAH1 and 2 and as a consequence is degraded via the proteasom, the dimerised form accumulates within the cells. This accumulation eventually leads to the oncogenic transformation of the cells. One possibility to circumvent this negative effect would be to inhibit the intra molecular interaction of the two generated protein fragments. The basic step to potentially inhibit the interaction was to determine the minimal interaction domains of the MLL protein. Appropriate interaction experiments were conducted using the bacterial two-hybrid system and a cell based protein-translocation-biosensor system. After minimising the interaction domains a direct interaction between the minimal C-terminal interaction domain (FYRC_B3) and the full length proteins MLL and AF4/MLL was successfully proven, indicating that it could be used as an inhibitor for the native intra molecular protein interaction. To determine the effect of the potential inhibitor on cells it was expressed in HeLa as well as in t(4;11)-positive SEM cells. The effect was measured by counting the number of dead cells resulting from the expression of an inhibitor by flow cytometry. The experiments showed that the presence of a short MLL fragment as a potential inhibitor of the wildtype protein interaction caused the typically fairly drug-resistant t(4;11)-positive cells to mortify. In summary the inhibition of the intra molecular protein interaction seems to be a very promising therapeutic approach for t(4;11)-related leukemias.
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Metadaten
Author:Clarissa Oehm
URN:urn:nbn:de:hebis:30-63831
Referee:Rolf Marschalek
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/04/22
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2009/03/30
Release Date:2009/04/22
Tag:AF4 ; MLL ; intramolekulare Proteininteraktion; t(4;11)
AF4 ; MLL ; intramolecular protein interaction; t(4;11)
SWD-Keyword:Akute lymphatische Leukämie ; Translokation
HeBIS PPN:211650609
Institutes:Pharmazie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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