Open Access

Wencke Hofmann

• Der Behandlungserfolg maligner Erkrankungen mit konventionellen Chemotherapeutika wird durch hohe Morbiditäts- und Mortalitätsraten infolge schwerer Nebenwirkungen aufgrund der unselektiven Wirkung auf den proliferierenden Zellpool und durch zunehmende Resistenzentwicklungen gegen das jeweils eingesetzte Therapeutikum limitiert. Zusätzlich wirken konventionelle Chemotherapeutika bei niedrig-malignen Tumoren mit geringer Proliferationsrate nur unzureichend. Intensive Forschungen beschäftigen sich deshalb mit der Entwicklung spezifischer Therapeutika, die ausschließlich den entarteten Zellklon angreifen, indem sie den zur Transformation der Zelle führenden molekularen Mechanismus, der zur Störung der Induktion oder des Ablauf des programmierten Zelltodes (Apoptose) oder zur gesteigerten Zellprogression führt, gezielt antagonisieren. SRC-Kinase-Inhibitoren gehören zu diesen innovativen Substanzen der so genannten „Molecular Targeted Therapy“. Sie hemmen selektiv SRC-Kinasen, die zur Gruppe der intrazellulären Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen zählen und an der Pathogenese verschiedener malignen Erkrankungen beteiligt sind. Ihr antiproliferatives Potential konnte in vitro sowohl in der Therapie solider Tumoren, als auch der CML und CLL nachgewiesen werden. In dieser Dissertation wurde gezeigt, dass die neuen SRC-Kinase-Inhibitoren AZD0424, AZD0530 und AZM559756 bei Einsatz mikromolarer Konzentrationen in der Lage sind, in Bcr-Abl-, c-Kit- und PDGF-negativen B-Zell-Lymphomzelllinien Apoptose zu induzieren und die Zellprogression durch Beeinflussung des Zellzykluses zu unterdrücken. Dabei erwies sich die Substanz AZD0424 als der am stärksten wirksame Apoptose-Induktor. Durch umfangreiche Untersuchungen der Responder- (DOHH-2 und WSU-NHL) und Nonresponderzellen (Jurkat und Raji) zur Apoptosekaskade konnten die Schlüsselmoleküle des durch die neuen SRC-Kinase-Inhibitoren induzierten programmierten Zelltodes identifiziert werden. So lies sich die Aktivierung des extrinsischen und intrinsischen Apoptoseweges nachweisen. In Responderzellen erfolgten eine Aktivierung von Initiator- (-8 und -9) und Exekutorcaspasen (-3, -6 und -7), die Zerstörung des mitochondrialen Membranpotentials sowie die Spaltung von Bid, Rb und PARP. Des Weiteren konnten in den Responderzellen eine Downregulation von antiapoptotischen Bcl-xl und eine Downregulation der Apoptoseinhibitoren Survivin, cIAP-1 und c-Flip als apoptosevorantreibene Schritte identifiziert werden. Ebenso lies sich ausschließlich in den behandelten Responderzellen eine Downregulation der c-Abl-Kinase und eine Verminderung der Akt-Phosphorylierung nachweisen. Die Untersuchung der basalen Expression der SRC-Kinasen in den getesteten Lymphomzelllinien bestätigte, dass SRC-Kinasen in unterschiedlichen malignen Erkrankungen fehlgesteuert sind und sich durch ein vom Normalzustand abweichendes Expressionsmuster auszeichnen. Des Weiteren konnten Lyn, Fyn und Lck als Haupteffektor-SRC-Kinasen der neuen SRC-Kinase-Inhibitoren identifiziert werden: so lies sich in allen behandelten Zellen eine Downregulation der SRC-Kinase Lck sowie der phosphorylierten Isoformen p-Lck-Tyr505 und p-Lyn-Tyr507 nachweisen. Durch vergleichende Western Blot Analysen zwischen Responder- und Nonresponderzelllinien gelang es, Charakteristika der Zellen zu identifizieren, die Erklärungen für das unterschiedliche Ansprechen der Zellen auf SRC-Kinase-Inhibitoren anbieten. So wurde gezeigt, dass sich Responderzellen im Gegensatz zu Nonresponderzellen durch eine deutlich geringere c-Myc Expression auszeichnen. Somit deckt diese Arbeit die molekularen Mechanismen der durch SRC-Kinase-Inhibitoren induzierten Apoptosekaskade in B-Zell-Lymphomzellen auf, zeigt wesentliche Schlüsselmoleküle der SRC-vermittelten intrazellulären Signaltransduktion auf, die letztendlich zur Initiierung des programmierten Zelltodes und der Inhibition der Zellzyklusprogression führen und identifiziert entscheidende, für das Ansprechend der Zellen verantwortliche Proteine. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass die neuen SRC-Kinase- Inhibitoren großes antiproliferatives Potential in B-Zell-Lymphomzellen besitzen. Damit stellen sie eine neue, aussichtsreiche Therapieoption in der Behandlung der Lymphomerkrankungen dar. Insbesondere für die Therapie der niedrig-malignen Non-Hodgkin-Lymphome, für die es trotz zahlreicher Forschungsbestrebungen bis heute keine kurativen Behandlungsmöglichkeiten gibt, könnten mit diesen Substanzen verbesserte Heilungschancen erzielt werden. Durch die Aufdeckung der molekularen Mechanismen der durch SRC-Kinase-Inhibitoren induzierten Apoptose, die sich in der Tat von denen der konventionellen Zytostatika unterscheiden, ergibt sich ferner die Möglichkeit, durch eine Kombination beider Chemotherapeutika synergistische Erfolge in der Behandlung maligner Erkrankungen zu erreichen. So könnten zum einen durch Einsatz niedriger Wirkstoffdosen die Nebenwirkungen für den Patienten reduziert werden. Zum anderen könnten mittels der neuen SRC-Kinase-Inhibitoren Resistenzen gegen konventionelle Zytostatika überwunden werden. Somit liefert diese Arbeit wesentliche Grundlagen für weitere, aussichtsreiche in vivo Untersuchungen der SRC-Kinase-Inhibitoren bezüglich einer Optimierung der Therapie der Lymphomerkrankungen.
• Most conventional cytotoxic drugs are characterized by severe side effects which lead to considerable morbidity and mortality in the treatment of malignancies. These drugs do not only destroy neoplastic cells but also harm healthy tissues. Moreover, their unspecific effects result in minimal cure rates especially in low grade malignancies, e.g. low grade Non-Hodgkin-Lymphomas. Primary or secondary resistance of the malignant clone presents the major clinical obstacle which prevents remission and definite cure. Therefore, the concept of “molecular targeted therapies” which specifically target the malignant clone while sparing normal cells is most appealing. Different substances like monoclonal antibodies or tyrosine kinase inhibitors are currently tested in clinical studies. SRC Kinase Inhibitors belong to this innovative group of “targeted therapies”. They selectively inhibit SRC-Kinases which are nonreceptor intracellular tyrosine kinases. These tyrosine kinase inhibitors are part of intracellular signalling pathways including regulation of proliferation, cell motility, adhesion, tumor invasiveness, angiogenesis, immune cell signalling, cell cycle control and apoptosis. Indeed, results from studies with SRC Kinase Inhibitors show that they are able to elicit antiproliferative effects, induce apoptosis, reduce cancer invasiveness and also exert inhibitory effects on Imatinib targets such as c-Kit and Bcr-Abl offering possibilities to overcome Imatinib resistance. In this dissertation could be demonstrated that three recently developed selective SRC Kinase Inhibitors (AZD0424, AZD0530 and AZM559756) are able to induce apoptosis and cell cycle arrest in Bcr-Abl-, c-Kit and platelet-derived growth factor (PDGF) -negative lymphoma cell lines. AZD0424 emerged to be the most effective of the three tested inhibitors, inducing the highest levels of apoptosis with the lowest concentrations. Treatment of DOHH-2, WSU-NHL, Raji, Karpass-299, HUT78 and Jurkat cells with escalating concentrations of SRC Kinase Inhibitors revealed that the tested substances were effective on these parameters in the cell lines DOHH-2 and WSU-NHL, whereas the other tested cell lines remained unaffected. Thus, the lymphoma cell lines could clearly be separated into a group of sensitive and resistant cell lines to these substances. Extensive examinations between sensitive and resistant cell lines according to the potential apoptosis inducing properties of the new SRC Kinase Inhibitors showed that extrinsic as well as intrinsic apoptosis pathways were activated only in sensitive cell lines. Downregulation of Survivin, c-IAP-1, Bcl-xl and c-Flip, enhanced activation of caspases -8, -9, -3, -7 and -6 and cleavage of PARP, Bid and Rb could be observed in responder cell lines upon treatment with SRC Kinase Inhibitors. Interestingly, protein levels of c-Abl were downregulated and Akt phosphorylation was decreased by treatment with SRC Kinase Inhibitor in responder cell lines while these parameters remained unaffected in non-responder cell lines. Assessment of SRC-Kinase expression in all cell lines revealed heterogeneous and irregular expression patterns not in accordance with expressional patterns detected in normal leukocytes. These observations once more support the hypothesis of deregulated expression of SRC Kinases in malignancies. In order to identify main target SRC Kinases especially influenced by the treatment of SRC Kinase Inhibitors, we analysed phosphorylated SRC Kinases and found that phosphorylation of Lyn and in particular Lck were affected most heavily by treatment with the SRC Kinase Inhibitors, and may therefore represent the candidate SRC Kinases responsible for mediating the apoptotic effects. Furthermore, basal expression levels of c-Myc were notably lower in sensitive cell lines as compared with non-sensitive cell lines, possibly providing an explanation for sensitivity versus resistance against these novel substances. In conclusion, these examinations show that new SRC Kinase Inhibitors AZD0424, AZD0530 and AZM559756 potently induce apoptosis and cell cycle arrest in certain types of lymphoma cell lines at micromolar concentrations and may therefore represent a promising new treatment option for these malignancies. Particularly for the therapy of low grade lymphomas and CLL, for which there are still no curative treatment possibilities, these substances could reach better cure rates. It could be demonstrated that apoptosis induction by these new agents is associated with the activation of a unique pattern of apoptosis pathways which considerably differ from pathways activated by other apoptosis inducers such as conventional cytotoxic drugs. This fact leads to the hypothesis that a combination of both treatment groups may achieve synergistic effects in the therapy of lymphomas. Additionally, SRC Kinase Inhibitors are promising weapons to overcome chemoresistance against conventional cytotoxic drugs.