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Marvin Oliver Ponnath

• Die Polo-like kinase 1 ist ein Schlüsselprotein bei der Steuerung mitotischer, meiotischer und zytokinetischer Prozesse. Um den korrekten Ablauf dieser Prozesse zu gewährleisten, muss die Menge an PLK1 in den verschiedenen Phasen des Zellzykluses genauestens reguliert werden. Eine Vielzahl verschiedener Tumorentitäten weisen eine stark erhöhte Konzentration an PLK1-Protein auf. Für die Krebsforschung ist es daher von großer Relevanz Aufschluss über solche Proteine zu erhalten, die Einfluss auf die PLK1 Expression nehmen. Dieses Wissen könnte dazu beitragen, Strategien für eine noch gezieltere Krebstherapie zu entwickeln. Die vorliegende Arbeit zeigt einerseits erste Hinweise für eine Rolle des multivalenten Transkriptionsfaktors CCCTC-binding factor (CTCF) für die Regulation des PLK1-Promotors und andererseits erste Anhaltspunkte für einen Einfluss der PLK1 auf die transkriptionsregulatorische Funktion von CTCF. Grundlage dieser Arbeit war die Identifikation einer putativen Binderegion von CTCF im Bereich des PLK1-Promotors, die die Frage aufkommen ließ, ob CTCF einen transkriptionsregulatorischen Einfluss auf den PLK1-Promotor besitzt. Deshalb wurden initial Reportergenanalysen durchgeführt, bei denen gezeigt werden konnte, dass CTCF die Promotoraktivität einer PLK1-Promotorsequenz, welche die putative CTCF-Binderegion beinhaltet, steigern kann. Zudem ist es gelungen, die Bedeutung der putativen Binderegion für die Aktivitätssteigerung herauszuarbeiten, da eine 50%ige Deletion dieses Bereiches mit einer deutlichen Reduktion der CTCFbedingten Induktion der Reportergentranskription einherging. Interessanterweise konnten in den daraufhin durchgeführten in vitro-Interaktionsstudien erste Daten, die für eine Interaktion von CTCF und PLK1 sprechen, gesammelt werden, wobei die Kombination der Ergebnisse aus dem GST-Pull-Down- und dem Co-Immunopräzipitationsexperiment die Aussage zulassen, dass diese Wechselwirkung auf Seiten der PLK1 über die Polo-Box-Domäne und auf Seiten von CTCF über die aminoterminale Domäne vermittelt wird. Mit dem Nachweis der in vitro-Phosphorylierbarkeit von CTCF durch PLK1 konnte zudem ein mögliche Funktion dieser Interaktion herausgearbeitet werden. Durch den Einsatz von CTCF-Deletionsmutanten und eines punktmutierten CTCF-Fragments gelang es in weiteren Phosphorylierungsstudien Serin-224 als PLK1-Phosphorylierungsstellen in CTCF zu identifizieren. Abschließend ist es im Zuge von Reportergenanalysen, die den Effekt einer S224A Mutante von CTCF mit demjenigen von CTCF Wildtyp verglichen, gelungen, erste Hinweise für einen Rolle von Serin 224 im Hinblick auf die transkriptionsregulatorische Modulation von CTCF zu sammeln.
• The Polo-like kinase 1 (PLK1) is a key regulator for mitotic, meiotic and cytokinetic mechanisms. To ensure the precise regulation of the mechanisms, the concentration of PLK1 during the different phases of the cell cycle has to be tightly controlled. Moreover, PLK1 is overexpressed in a broad spectrum of cancer types. It is therefore of great value for cancer research to elaborate the comprehension of proteins that influence the expression of PLK1, because this might contribute to the development of a more targeted cancer therapy. This study describes the role of the multivalent transcription factor CCCTC-binding factor for the regulation of the PLK1 promotor and moreover the influence of PLK1 on the transcriptional activity of CTCF. The basis of this work was the identification of a putative binding region of CTCF in the PLK1 promotor, which prompted the question, whether CTCF has a transcriptional effect on the PLK1 promotor. For that reason reporter gene assays were carried out with the result that CTCF is able to induce the promoter activity of a PLK1 promotor sequence that includes the putative CTCF binding region. Furthermore it was shown that this putative binding region is essential for the transcriptional activity of the promotor because the deletion of 50% of this area resulted in a marked reduction of the CTCF-dependent reporter gene activation. The data obtained by GST-pull-down- and coimmunoprecipitation assays provided evidence of a physical interaction between the Polo-Box-Domain of PLK1 and the aminoterminal region of CTCF. In addition, kinase assays showed the ability of PLK1 to phosphorylate CTCF in vitro and thereby offers a functional interpretation for the detected interaction. By generating CTCF deletion mutants and a site-mutated CTCF-fragment it was possible to identify serine 224 as a putative in vitro phosphorylation site for PLK1 in CTCF. Finally, the results of additional reporter gene assays, testing the effect of a S224A mutant of CTCF indicate a role for serine 224 in modulating the transcriptional effect of CTCF.