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Natalia Kiseleva

• Summary and Outlook The aim of this work was the investigation of the Mn2+ binding sites in hammerhead and the Diels-Alder ribozymes. This project consists of three main topics. In the first part quantification and structural characterization of Mn2+ binding sites in the m- and the tsHHRz using Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy are described. The second part summarizes the newest results obtained for the cleavage activity of both mand tsHHRzs in the presence of different Mg2+ and Mn2+ and Na+ ion concentrations using the new method with fluorescent-labeled RNAs. Here the influence of neomycin B on the structure of Mn2+ binding pockets and on the catalytic activity of both HHRzs is discussed. In addition, a possible role of Mn2+ ions is suggested from correlation of the EPR data with the kinetic results. The last chapter is devoted to quantification and differentiation of Mn2+ binding sites of the Diels-Alder ribozyme using continuous wave (cw) EPR experiments in solution. In this work EPR spectroscopy was used to study the binding of Mn2+ ions to the cis tsHHRz and to compare it with the binding to the trans mHHRz and to the Diels-Alder ribozyme. Cw EPR measurements showed that the tsHHRz possesses a single highaffinity Mn2+ binding site with a KD of < 10 nM at a NaCl concentration of 0.1 M. This dissociation constant is three orders of magnitude smaller than the KD determined for the single high-affinity Mn2+ site in the mHHRz (KD = 4.4 &#956;M). The measurements of catalytic activity have been performed using fluorescent-labeled RNAs. Compared to the mHHRz, the cis tsHHRz cleaves up to 20-fold faster in the presence of Mg2+/Mn2+ ions with no saturation of the cleavage rates at high metal(II) ion concentrations. This is in good agreement with the last investigations on the trans tsHHRz (Nelson et al. 2005). Thus, the much stronger Mn2+ binding and higher cleavage activity were attributed to the interaction between the two external loops of the tsHHRz which reduces the RNA dynamics and traps the Mn2+ in the tightly folded conformation. Intriguingly, according to the EPR studies the binding constants for Mn2+ ions are several orders higher than the concentration of Mn2+ ions required for the catalytic activity (mHHRz: KD = 4.4 ± 0.5 &#956;M and the Mn2+ concentration required to achieve half of the maximum cleavage rate [Mn2+]1/2 = 4.1 ± 0.6 mM respectively). Therefore, strongly bound Mn2+ ions seem to be needed for the folding of the HHRz, whereas weakly bound metal(II) ions are required to achieve full catalytic activity, and may be directly involved in catalysis. A comparison between the Electron Spin Echo Envelope Modulation (ESEEM) and Hyperfine Sublevel Correlation (HYSCORE) spectra of m- and tsHHRz demonstrates that both binding sites in HHRzs are structurally very similar. This suggests that the Mn2+ is located in both ribozymes between the bases A9 and G10.1 of the sheared G•A tandem basepair, as shown previously and in detail for the mHHRz (Vogt and DeRose 1998, Schiemann et al. 2003). However, the hyperfine spectra of the tsHHRz with 15N labeled G10.1 revealed no difference in comparison with the ones with 14N. This leads to an interpretation that the Mn2+ binding sites in both ribozymes are not identical. In addition, aminoglycoside antibiotic neomycin B inhibits the cleavage activity of both despite of the fact that it displaces the high-affinity Mn2+ ion only from the mHHRz. Hence, binding of neomycin B to the m- and the tsHHRzs probably occurs at different sites and neomycin B displaces only loosely bound Me2+ ions from the tsHHRs, whereas in the mHHRz both the high-affinity ion and the weakly bound ions are replaced. Therefore, it cannot be excluded that weakly bound Mg2+/Mn2+ ions, together with looploop interactions, induce a structural rearrangement which brings the high-affinity ion closer to the cleavage site. In the case of the Diels-Alder ribozyme it possesses five Mn2+ binding sites with KD = 0.6 ± 0.2 &#956;M in solution under conditions where it is catalytically active. The competition experiment with Cd2+ allows to distinguish three different types of Mn2+ binding sites in the Diels-Alder ribozyme including inner-sphere monomeric Mn2+, monomeric Mn2+ bound through water-mediated contacts and electronically coupled dimeric Mn2+. Three Mn2+ ions are more strongly bound to the ribozyme via inner-sphere contacts, whereas two other Mn2+ ions form water-mediated outer-sphere contacts with the nucleotides of the ribozyme. The inner-sphere Mn2+ with the highest affinity and the fourth Mn2+ ions added to the ribozyme form a dimer with a Mn2+-Mn2+ distance of ~6 Å (as arises from simulations). Moreover, an addition of the product analog inhibitor (AMDA) to the [Diels-Alder ribozymes/ Mn2+] complex shows no conformational changes in the Mn2+ binding pockets. This is in good agreement with the recent studies which suggest that the Diels-Alder ribozyme is preorganized (Keiper et al. 2004). Some considerations on the evolution of the project (Outlook) There may be several venues of continuation of this project, which exploit on unique combination of EPR experiments and biochemical studies on RNA. This combination may allow us to significantly contribute to understanding of metal role in HHRz catalysis. Since the tsHHRz possesses the high affinity Mn2+ binding site (Kd < 10 nM) it creates a possibility to find conditions where the structural site is occupied by Mn2+, while catalytic sites are occupied by Mg2+ ions. If these conditions will be established by EPR titration, a set of standard biochemical experiments may be designed to look at the kinetic of cleavage and differentiate the “structural” and catalytic effects. The other experiment would be to look at the Mn2+ binding site in the tsHHRz in comparison with P1 and P1/P2 complexes and compare the results with the ones for the mHHRz. No matter the answer, P1 can be used as a simpler model to study the effect of tertiary structure on Mn2+ binding. A set of the tsHHRz mutants can be created to observe the mutations affect on Mn2+ binding sites, Mn2+ affinity and correlate the data with the kinetic analysis. FRET-based kinetic assay with fluorophore pairs on P1 and P2 can be designed for the kinetic experiments. Having this system one will be able to perform kinetic measurements 100-fold faster comparing to standard gel procedures (everything will be done in 96-wells). By manipulating the lengths and the sequence of P2 we most likely will be able to use FRET assay for the chemical step analysis (provided Kd > k2), and measure it using stop-flow system with time resolution of microseconds. And finally, one will be able to quantitatively measure the effect of neomycin B on the tsHHRz. Another interesting possibility would be to look at the state of metal(II) in the tsHHRz – enzyme alone (dissociated product) and in the enzyme-product complex and compare with the full-length tsHHRz. It will provide the information about the local rearrangements upon catalysis and the role of metal(II) ions. Furthermore, additional pulse-EPR experiments using 15N labeling have to be performed in order to reveal the location of the high-affinity Mn2+ binding site in the tsHHRz. Additionally, paramagnetic Mn2+ ions can be localized within the global fold of HHRzs using PELDOR and site-directed spin labeling. Further characterization of the high-affinity binding site in the tsHHRz can be performed using high-field ENDOR measurements in order to obtain the 14N and 31P tensors.
• Deutsche Zusammenfassung RNA ist ein einzigartiges Biomakromolekül, da es sowohl Träger genetischer Information als auch Katalysator für vielfältige zelluläre Reaktionen ist. Wie bei der DNA ist in der RNA die genetische Information in der Abfolge der Basen, der Primärstruktur enthalten. Im Gegensatz zur DNA kann die RNA aber auch eine Vielzahl unterschiedlicher sekundärer und tetiärer Strukturen aufweisen, die für ihr katalytisches Potential entscheidend sind. Solche katalytisch wirksamen RNAs werden in Anlehnung an die auf Aminosäuren basierenden Enzyme als Ribozyme bezeichnet. Auf RNA gerichtete Liganden/Effektoren können die dreidimensionale Struktur der RNA verändern und deren Wechselwirkung mit dem Substrat verhindern oder verstärken. Dadurch ergibt sich die vielversprechende Möglichkeit auf der RNA-Ebene in die Schlüsselprozesse der Zelle einzugreifen und Ribozyme zu einem attraktiven Ziel für pharmakologische Wirkstoffe zu machen. Voraussetzung für die Entwicklung von RNA-gerichteten pharmakologischen Wirkstoffen ist jedoch ein fundiertes molekulares Verständnis der RNA-Struktur, -Faltung, -Ligandwechselwirkung (Gestland und Atkins 1993, Patel 1998). Dieses Projekt zielt auf den Einfluss, den Magnesium- bzw. Manganionen auf die Tertiärstruktur und die katalytische Aktivität von Ribozymen haben. Die wichtigen Punkte hierbei sind die Quantifizierung, Charakterisierung und Lokalisierung der Metallionen in den Ribozymen in Lösung. Metall-Ionen sind wichtig für die Struktur und die Funktion der RNA (Gesteland und Atkins 1993, Eckstein und Lilley 1997, Patel 1998, Puglisi und Puglisi 1998, Scott 1999, Woodson 2000, Doherty und Doudna 2001). Die monovalenten Metall-Ionen fördern die RNA-Faltung, während die divalenten Metall-Ionen für die Tertiärstruktur nötig sind. Das minimale Hammerhead-Ribozym benötigt Magnesiumionen in ausreichender Konzentration, um sich in die katalytisch aktiven Konformationen falten zu können, wie mit biochemischen Methoden und Fluoreszenzmessungen nachgewiesen wurde (Ruffner and Uhlenbeck 1990, Lilley 1999). Es wird angenommen, dass die Strukturänderungen in Richtung auf den Übergangszustand durch Koordination von Magnesiumionen während der Katalyse induziert und stabilisiert werden (Lilley 1998, Cech et al., Wyatt and Tinoco 1993). Diese Arbeit besteht aus drei Teilen. Der erste beschäftigt sich mit der Quantifizierung und der strukturellen Charakterisierung von Mn2+-Bindungstaschen in den trans-minimalen und cis-tertiär-stabilisierten Hammerhead-Ribozymen mit Hilfe von EPR-Methoden. Der zweite Teil gibt einen Überblick über die katalytische Aktivität der beiden Hammerhead-Ribozyme in Pufferlösungen mit divalenten und monovalenten Ionen-Zusätzen. Dabei werden die durch Neomyzin-Bindung induzierten Strukturänderungen der Mangan(II)-Bindungstaschen sowie der Einfluss des Neomyzins auf die katalytische Aktivität untersucht. Dieser Teil der Arbeit schließt mit einer Korrelation der Kinetik-Ergebnisse mit EPR-Daten, womit eine mögliche Funktion der Mangan(II)-Ionen vorgeschlagen werden kann. Der darauf folgende Teil gibt einen Überblick über Quantifizierung und Charakterisierung der hochaffinen Metall(II)-Bindungsstellen im Diels-Alder-Ribozym. EPR-Studien Ein Schwerpunkt dieser Arbeit ist, es im Zusammenspiel von cw-(continuous wave) und Hyperfeinspektroskopie (ESEEM: Electron Spin Echo Envelope Modulation, HYSCORE: Hyperfine Sublevel Correlation Spectroscopy) Strukturinformationen der katalytische Ribozyme zu gewinnen sowie eine strukturelle Charakterisierung von Mn2+-Bindungstaschen in Ribozym-Systemen durchzuführen und Strukturänderungen bei Wechselwirkungen mit kleinen organischen Molekülen (Neomyzin B, AMDA) in Lösung zu untersuchen. Dabei wurden einerseits globale Strukturelemente sowie lokale Strukturmerkmale, wie die Bindungsgeometrie von Metallionen, mittels Hyperfeinspektroskopie bestimmt. Hammerhead-Ribozyme Zunächst wurden EPR-Experimente zu Bindungsstellen im minimalen (m-) und tertiärstabilisierten Hammerhead-Ribozym (tsHHRz) durchgeführt. Dabei wurde diamagnetisches Mg2+ durch paramagnetisches Mn2+ (I und S = 5/2) substituiert. Die Verwendung des isostrukturellen aber paramagnetischen Mn2+ ermöglichte die direkte EPR-spektroskopische Untersuchung der Bindungsstelle in Lösung. Auf die gleiche Weise wie in den Studien von DeRose (Horton et al. 1998) wurden im nächsten Schritt anhand von Konzentrationsmessungen (gebundenes Mn2+ - freies Mn2+) die Bindungskonstanten und die Anzahl von hochaffinen Manganbindungsstellen mit cw-XBand-EPR bestimmt. Dabei wurden die Bedingungen für eine selektive Besetzung derhochaffinen Bindungsstelle etabliert. Man nutzt dabei aus, dass gebundene und ungebundene Mn2+-Ionen leicht im Spektrum unterschieden werden können. Der ungebundene Zustand zeichnet sich durch scharfe Hyperfeinlinien aus, während das RNA-gebundene Mn2+ spektral zu breit ist und deshalb kein Signal bei Raumtemperatur liefert. Minimales Hammerhead-Ribozym (mHHRz) Das mHHRz (Abbildung 1.1a) ist ein gutes Modellsystem zur mechanistischen Untersuchung der Spaltung von Phosphordiesterbindungen, wie sie im Spleißvorgang auftritt. In der Kristallstrukturen des mHHRzs wurde eine Mg2+/Mn2+-Bindungsstelle zwischen den Nukleotiden A9 und G10.1 gefunden (Pley et al.1994, Scott et al. 1995, 1996), die jedoch 22 Å von der Spaltungsstelle entfernt ist, was zu weit für eine Beteiligung dieses Manganions am katalytischen Mechanismus ist. Es blieb gleichwohl die Frage, ob die Struktur im Kristall der katalytisch aktiven Konformation in Lösung entspricht. Mit cw- und gepulster X-Band-EPR-Spektroskopie wurde gezeigt, dass in Lösung ein hochaffin gebundenes Mn2+ an die gleiche Stelle im mHHRz gebunden ist wie im Kristall. Mit Hilfe von cw-EPR-Experimenten wurde unter den verwendeten Salzbedigungen von 1 M NaCl nur eine einzige hochaffine Mn2+-Bindungsstelle mit Bindungskonstante Kd von 4.4 &#956;M gefunden. Verwendet man eine Salzkonzentration 0.1 NaCl werden insgesamt vier Mn2+ gebunden. Die aus den X-Band-ESEEM- und HYSCORE-Spektren gewonnenen 14NHyperfein- und Quadrupoldaten: Quadrupolkopplungskonstante &#954; = 0.7 MHz, Asymmetrieparameter &#951; = 0.4 und isotrope Hyperfeinkopplungskonstante Aiso(14N) = MHz sprechen dafür, dass Mn2+ mit einem einzigen Stickstoff gekoppelt ist. Zur strukturellen Interpretation der Hyperfein-Daten wurden begleitend DFT-Rechnungen den Mangan-Komplexen durchgeführt. Die Werte der EPR-Experimente wurden mit den DFT-Rechnungen verglichen (&#954;(14N) = +0.80 MHz, &#951; = 0.324, and Aiso(14N) = +2.7 MHz), wodurch gefolgert werden kann, dass das hochaffine-Mn2+-Ion im Kristall und gefrorener Lösung an die gleiche Bindungsstelle gebunden ist. Tertiär-stabilisiertes Hammerhead-Ribozym (tsHHRz) Vor kurzem wurde entdeckt, dass die Berücksichtigung von nicht-konservierten Sequenzelementen, die außerhalb des katalytischen Kerns liegen, zu einer höheren katalytischen Aktivität des HHRzs unter physiologischen Salzkonzentrationen und führt (Abbildung 1.1b, Khvorova et al. 2003). Bei diesen nicht-konservierten Sequenzelementen handelt es sich um einen Loop am Ende von Stamm I und einen Loop am Ende von Stamm II. Auf der Basis von vergleichenden Aktivitäts-, Struktur-, Mutations- und Modelling-Studien wurde vorgeschlagen, dass die höhere Aktivität auf einer Interaktion zwischen diesen Loops beruht, da diese Interaktion zu einer Stabilisierung der katalytisch aktiven Konformation führt. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit ist, herauszufinden inwieweit sich dadurch die Mn2+-Bindungsstellen in Struktur und Lokalisation sowie die katalytische Aktivität des HHRzs verändern. Auf die gleiche Weise wie beim mHHRz wurde zunächst die Anzahl der hochaffinen Manganbindungsstellen mit cw-X-Band-EPR bestimmt. Dabei wurde eine einzige hochaffine Mn2+-Bindungsstelle mit einer Bindungskonstante Kd &#8804; 10 nM bei der verwendeten Salzkonzentration von 1 M NaCl gefunden. In Pufferlösung mit 0.1 M NaCl-Zusatz können jedoch insgesamt bis zu drei Mn2+-Ionen mit Kd von 150 ± 10 &#956;M an das tsHHRs kooperativ gebunden werden. Zur weiteren Untersuchung wurden mit Hilfe von Hyperfeinspektroskopie die strukturelle Charakterisierung und Lokalisierung der hochaffinen Mn2+-Bindungsstelle im tsHHRz fortgesetzt. In den ESEEM- und HYSCORE-Spektren von beiden HHRzs konnten aber keine Unterschiede nachgewiesen werden. Das spricht dafür, dass die Struktur und die Position der hochaffinen Manganbindungsstelle in beiden Ribozymen gleich ist. Mittels ESEEM-Spektroskopie und 15N-markiertem Guanin wurde für die hochaffine Mn2+-Bindungsstelle im mHHRz bereits nachgewiesen, dass das Mn2+-Ion von einem N7-Guaninstickstoff von G10.1 koordiniert ist (Morrissey et al. 1999). Zusätzlich wurden in dieser Arbeit an tsHHRz solche ESEEM- und HYSCORE-Messungen mit 15N-markiertem Guanin (G10.1) zur Lokalisation einer hochaffinen Mn2+-Bindungsstelle im tsHHRz durchgeführt, um diese Mangan(II)-Bindungsstelle zu selektieren und nachzuweisen, dass das Mn2+-Ion mit dem gleichen Guaninstickstoff wie im mHHRz gekoppelt ist. Die Ergebnisse der Hyperfeinspektroskopie führten schließlich zu der Interpretation, dass das Mn2+-Ion im tsHHRz von dem N7 eines anderen Guanins koordiniert ist. Jedoch kann man die Koordination von N7 des gleichen Guanins in den beiden HHRzs noch nicht ausschließen. Weitere Experimente sind nötig, um nachzuweisen, dass das richtige Guanin mit 15N markiert wurde. Metall-induzierte Spaltung Es wurde bereits herausgefunden, dass die katalytische Aktivität des Ribozyms durch mono- und divalente Metallionen gesteuert wird (Hamman und Lilley 2002). Jedoch blieb noch die Frage offen, ob die divalenten Metallionen, wie Mg2+ und Mn2+, direkt den katalytischen Zyklus involviert sind. Zu diesem Zweck wurde der Einfluss der Magnesium- und Manganionen auf die beobachteten Spaltungsraten für das trans-m- und das cis-tsHHRz untersucht und Resultate mit aus der EPR-Spektroskopie gewonnenen Daten korreliert. Auf diese kann ein Einblick in die Frage, ob und wenn ja welche Metall(II)ionen im HHRz und tsHHRz direkt in den Katalysezyklus involviert sind, gewonnen werden. Die neue Methode basierend auf den fluoreszenz-gelabelten RNAs wurde erfolgreich angewandt. Mit Hilfe dieser Methode konnte zum ersten Mal die schnelle Kinetik vom cis-tsHHRz gemessen werden. Es wurde gezeigt, dass die Raten vom tsHHRz bis zu 20-fach schneller als die vom mHHRz unter den gleichen Bedigungen sind. Erhöht man die Mangankonzentration, gibt es keine Sättigung für die Raten des tsHHRzs, während dasmHHRzs seine größte katalytische Aktivität erreicht. Das stimmt mit den Ergebnissenaus den neueren Studien zu dem trans-tsHHRz überein (Nelson et al. 2005). Die stärkere Bindung und die höhere Spaltungsaktivität können darauf zurückzuführen sein, dass dieDynamik der RNA durch die Loop/Loop-Wechselwirkung reduziert ist und deswegen das Mn2+-Ion in der enger gefalteten Konformation eingeschlossen. Die Mn2+-Ionen führen zu der 60-fach schnelleren Spaltung der beiden HHRzs als die Mg2+-Ionen. Interessant ist, dass die Mangankonzentrationen die man für die Katalyse braucht, viel höher als die aus den EPR-Messungen gewonnenen Dissoziationskonstanten und deshalb wurde vorgeschlagen, dass die hochaffinen Mn2+-Ionen nur für die Faltung essentiell sind und nicht direkt am katalytischen Mechanismus teilnehmen. Die schwach gebundenen Mn2+-Ionen sind erforderlich, um die volle katalytische Aktivität hervorzurufen und sind vermutlich direkt in den Katalysezyklus involviert. Das steht im Einklang mit den FRETund NMR-Daten (Penedo et al. 2004, Hammann et al. 2001) sowie mit den neuesten Kinetik-Studien zu dem trans-tsHHRz (Kim et al. 2005). Der Einfluss des Neomyzins B Die Spezifität der Aminoglykosid/RNA-Wechselwirkung und der Mechanismus der Bindung wurden an einigen Beispielen vor kurzem untersucht (Hermann und Westhof 1998). Zur weiteren Charakterisierung wurde in dieser Arbeit der Einfluss von Neomyzin B auf globale Strukturelemente und die Mn(II)-Bindungsstellen in den Ribozymen erforscht. Mit Hilfe von EPR-Messungen wurde geklärt, dass im tsHHRz das stark gebundene Mangan durch die Bindung von Neomyzin B nicht freigesetzt wurde, während das hochaffine Mn2+-Ion im mHHRz durch Neomyzin B ersetzt wurde. Interessant ist, dass Neomyzin B die katalytische Aktivität von beiden HHRzs reduziert. Obwohl Neomyzin B an den beiden Ribozymen bindet, scheint die Bindungsstelle in den Ribozymen nicht die gleiche zu sein. Deshalb wurde vorgeschlagen, dass die Inhibition der Aktivität des tsHHRzs vielleicht aufgrund der Verdrängung der schwach gebundenen Me2+-Ionen erfolgt, welche für die Spaltung erforderlich sind, während die beiden hochaffinen Mn2+-Ionen sowie die schwach gebundenen Ionen aus dem HHRz verdrängt wurden. Man kann nicht ausschließen, dass die schwach gebundenen Mn2+-Ionen im Zusammenhang mit der Loop/Loop-Wechselwirkung die strukturelle Änderungen induzieren, welche das hochaffine Mn2+-Ion näher zur Spaltungsstelle bringen. Diels-Alder-Ribozym Vor kurzem wurden neue Ribozyme isoliert, die die Knüpfung von Kohlenstoff- Kohlenstoff-Bindungen durch die so-genannte Diels-Alder-Reaktion ermöglichen (die Diels-Alder Ribozyme) (Abbildung 2.1a). Der letzte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Quantifizierung und Charakterisierung der Metall(II)-Bindungsstellen im Diels-Alder-Ribozym in Lösung. Dabei wurden zunächst mit Hilfe von cw-EPR-Messungen fünf hochaffine Mn2+-Bindungsstellen mit einer Durchschnittsdissoziationskonstante Kd von 0.6 ± 0.2 &#956;M gefunden. Interessant ist, dass im Gegensatz zu den HHRzs die Anzahl der Mn2+-Bindungsstellen unabhängig von der NaCl-Konzentration ist. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Mn2+-Ionen durch Cd2+-Ionen ersetzt werden können. Davon ausgehend wurden mit Hilfe von cw-EPR-Messungen an Proben mit verschiedenen Kombinationen von den Cd2+- und Mn2+-Ionen-Equivalenten in gefrorener Lösung Mn2+-Bindungsstellen selektiert. Drei verschiedene Typen von Mn2+-Ionen konnten nachgewiesen werden: direkt koordiniertes monomeres Mn2+, über Wassermoleküle koordiniertes Mn2+ und dimeres Mn2+. Aus Spektrensimulationen ergab sich ein Abstand von &#8764;6 Å zwischen zwei Manganzentren mit unterschiedlichen Nullfeld-Aufspaltungen D1 = 400 G, D2 = 1000 G. Dieser Abstand stimmt gut mit dem aus der Kristallstruktur ermittelten Wert von 7.4 Å überein (Serganov et al. 2005, 3.5 Å Auflösung). Weitere Experimente bei hohem Magnetfeld werden benötigt. Durch die Linienverschmälerung können im Hochfeld auf den Mn2+-Hyperfeinlinien z.B. dipolare Kopplungen direkt abgelesen werden (field sweep oder cw-EPR). Zusätzlich werden durch das hohe Magnetfeld die Beiträge von unterschiedlichen Kernen durch die hoch Kern-Zeeman-Auflösung separiert (ENDOR). Zusätzlich wurde mit Hilfe von cw-EPR und gepulsten Methoden gezeigt, dass die Bindung vom Substrat (AMDA) zu keiner Strukturänderung des Diels-Alder-Ribozyms führt. Das stimmt überein mit den Ergebnissen, dass das Diels-Alder-Ribozym vorgeformt ist (Keiper et al. 2004).