Spectroscopical investigations to determine RNA-ligand interactions and RNA dynamics

Spektroskopische Untersuchungen zur Bestimmung von RNA-Ligand-Wechselwirkungen und RNA-Dynamiken

This thesis describes the structural characterization of interactions between biological relevant ribonucleic acid biomacromolecules (RNAs) and selected ligands to optimize the methodologies for the design of pharmacolog
This thesis describes the structural characterization of interactions between biological relevant ribonucleic acid biomacromolecules (RNAs) and selected ligands to optimize the methodologies for the design of pharmacological lead compounds. To achieve this aim, not only the structures of the RNA, the ligand and their complexes need to be known, but also information about the inherent dynamics, especially of the target RNA, are necessary. To determine the structure and dynamics of these molecules and their complexes, liquid state nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) is a suitable and powerful method. The necessity for these investigations arises from the lack of knowledge in RNA-ligand interactions, e.g. for the development of new medicinal drugs targeting crucial RNA sequences. In the first chapters of this thesis (Chapters II to IV), an introduction into RNA research is given with a focus on RNA structural features (Chapter II), into the interacting molecules, the biology of the specific RNA targets and the further development of their ligands (Chapter III) and into the NMR theory and methodologies used within this thesis (Chapter IV). Chapter II begins with a description of RNA characteristics and functions, placing the focus on the increasing attention that these biomacromolecules have attracted in recent years due to their diverse biological functionalities. This is followed by a detailed description of general structural features of RNA molecules. The biological functions of the RNAs investigated in this thesis (Human immunodeficiency virus PSI- and TAR-RNA and Coxsackievirus B3 Stemloop D in the 5’-cloverleaf element), together with their known structural characteristics are introduced in Chapter III. Furthermore, a description of the investigated ligands is given, focusing on the methods how their affinity and specificity were determined. The introduction is completed in Chapter IV, where the relevant NMR theory and methodologies are explained. First, kinetics and thermodynamics of ligand binding are summarized from an NMR point of view. Subsequently, a detailed description of the resonance assignment procedures for RNAs and peptidic ligands is given. This procedure mainly concentrates on the assignment of the proton resonances, which are essential for the later structure calculation from NMR restraints. The procedure for NMR structure calculation of RNA and its complexes follows with a short introduction into the programs ARIA and HADDOCK. The final part of this chapter explains the relaxation theory and the methodology to extract dynamic information from autocorrelated relaxation rates via the model-free formalism. In the Chapters V to VII of this thesis, the original publications are included and grouped into three topics. Chapter V comprehends the publications on the investigations of HIV PSI-RNA and its hexapeptidic ligand. These three publications[1-3] focus on the characterization of the ligand and its binding properties, its structure and the optimization of its composition aiming to improve its usage for further spectroscopic investigations.
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Die vorliegende Doktorarbeit behandelt die strukturelle Aufklärung von Wechselwirkungen zwischen biologisch relevanten Ribonukleinsäuren (RNA) und ausgewählten Liganden, sowie die Bestimmung der inhärenten Dynamik der RN
Die vorliegende Doktorarbeit behandelt die strukturelle Aufklärung von Wechselwirkungen zwischen biologisch relevanten Ribonukleinsäuren (RNA) und ausgewählten Liganden, sowie die Bestimmung der inhärenten Dynamik der RNA, um zur Methodenentwicklung für den Entwurf neuer Pharmaka beizutragen. Zur Bestimmung sowohl der Strukturen, als auch der Dynamiken stellt die Flüssig-Kernspinresonanz-Spektroskopie (NMR) eine ideale biophysikalische Methode dar. Die ersten Hälfte dieser Doktorarbeit gibt zum einen eine Einleitung in die RNA-Forschung mit besonderem Fokus auf den allgemeinen strukturellen und dynamischen Eigenschaften von Ribonukleinsäuren, stellt zweitens die ausgewählten RNA-Zielstrukturen und deren mit verschiedenen Methoden bestimmten Liganden vor, und erklärt drittens die zugrundeliegende NMR-Theorie und die verwendeten Methoden zur Untersuchung der Bindungs¬charakteristika, zur Strukturbestimmung der RNA und der Liganden und zur Ableitung dynamischer Parameter aus experimentellen Daten. Die zweite Hälfte dieser Arbeit ist der kumulative Teil und enthält die Originalpublikationen, die in drei Themenbereiche eingeteilt sind. Zuerst sind die drei Publikationen gruppiert, in denen die Bestimmung und Charakterisierung peptidischer Liganden der HIV Psi-RNA und deren Wechselwirkungen miteinander behandelt werden. Durch einen Phage-Display Assay wurde zunächst eine Konsensus¬sequenz eines peptidischen Liganden identifiziert (HWWPWW). Zur Verbesserung der Bindungseigenschaften wurde das Hexapeptid mittels einer Sequenzvariierung auf einer Membranoberfläche (SPOT-Assay) weiter optimiert (HKWPWW). Die weiteren strukturellen Untersuchungen der RNA-Ligand-Wechselwirkungen wurden per Fluoreszenz- und NMR-Spektroskopie durchgeführt, wobei die NMR-Spektroskopie aufzeigen konnte, dass das Peptid HKWPWW in zwei Konformationen der zentralen Prolinpeptidbindung zu beinahe gleichen Anteilen vorliegt. Die nächsten zwei Publikationen beschreiben die Ligandselektion gegen die Zielstruktur HIV TAR und die Strukturaufklärung des Komplexes mittels NMR-Spektroskopie. Als Liganden wurden Tripeptide synthetisiert, in denen zwei Arginine eine synthetische Aminosäure mit aromatischen oder hetero¬aromatischen Gruppierungen in ihrer Seitenkette flankieren. Mittels Fluoreszenz-Resonanz¬energietransfersichtung (FRET-Assay) wurde eine Vorauswahl der Liganden vorgenommen und die Interaktionen der ausgewählten Liganden mit der RNA per NMR-Spektroskopie konkretisiert. Eine intensive strukturelle Untersuchung des Liganden mit einer Pyrimidinylgruppe in der Seitenkette der zentralen Aminosäure in Komplex mit der TAR RNA ergab eine 2:1 Bindungsstöchiometrie des Liganden. Die erste stärkere Bindungsstelle im Bulge der RNA war bereits weitgehend bekannt als Ziel von Arginin-tragenden Liganden. Die strukturellen Untersuchungen konnten jedoch auch die zweite Bindungsstelle des Tripeptids unterhalb des Bulges lokalisieren. Zuletzt sind die zwei Publikationen zur Untersuchung der RNA-Dynamik zusammengefasst. Aus autokorrelierten Relaxationsraten der Kerne C1’ und C8 (für Purine) bzw. C6 (für Pyrimidine) in Nukleotiden der RNA Tetraloopsequenzen UUCG und CACG wurden mittels des Model-Free Formalismus Parameter abgeleitet, die über Dynamiken auf der Zeitskala von Pico- bis Nanosekunden der C-H Vektoren berichten. Die Verwendung optimierter und neuer Werte der C-H Bindungslänge und der Anisotropie der 13C-chemischen Verschiebung (13C-CSA) ermöglichte eine genauere Ableitung der inhärenten Dynamiken dieser RNA Moleküle. Diese Informationen konnten in die strukturellen Untersuchungen der glykosidischen Bindung durch kreuzkorrelierte Relaxationsraten eingebaut werden. Des Weiteren konnten die dynamischen Parameter bei verschiedenen Temperaturen mit Parametern abgeglichen werden, die aus Molekular-Dynamischen (MD) Trajektorien abgeleitet wurden. Dies ermöglichte die Visualisierung der internen Bewegungen zweier strukturell ähnlicher Tetraloops aus der YNMG-Familie, die sich aber in ihrer Stabilität unterscheiden. Bei Temperaturen nahe dem Schmelzpunkt des weniger stabilen CACG-Tetraloops offenbarten sich die Änderungen in der Dynamik, die zum Aufschmelzen des Loops führen.
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Metadaten
Author:Jan Ferner
URN:urn:nbn:de:hebis:30-73225
Referee:Harald Schwalbe
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2010/01/05
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2009/11/24
Release Date:2010/01/05
Tag:NMR-spectroscopy ; RNA ; dynamics ; ligand interactions ; molecular structure
SWD-Keyword:Dynamik ; Ligand ; Ligand <Biochemie> ; Molekülstruktur; NMR-Spektroskopie ; RNS ; Wirkstoff-Rezeptor-Bindung
HeBIS PPN:219351791
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $