Untersuchungen zum Metabolismus und zur Apoptoseinduktion von Purinanaloga und Pyrimidinanaloga in myeloischen und lymphatischen Zellen

Die Purinanaloga Cladribin und Fludarabin sowie die Pyrimidinanaloga Cytarabin und Gemcitabin sind wichtige Bestandteile in der Behandlung Iymphoproliferativer und hämatologischer Erkrankungen. Die zwei Hauptmechanismen 
Die Purinanaloga Cladribin und Fludarabin sowie die Pyrimidinanaloga Cytarabin und Gemcitabin sind wichtige Bestandteile in der Behandlung Iymphoproliferativer und hämatologischer Erkrankungen. Die zwei Hauptmechanismen der zytostatisch wirksamen Medikamente sind zum einen die Induktion der Apoptose und zum anderen die Hemmung der ZeIlproliferation. Beide Wege führen am Ende zum Untergang der Zelle und damit zur Tumorregression. In verschiedenen klinischen Studien wurde die klinische Wirksamkeit der Nukleosidanaloga demonstriert. Das Ziel der Kombinationen etablierter Substanzen mit neuen Medikamenten ist der Erhalt additiver und synergistischer Effekte, resultierend in einer Erhöhung der klinischen Effektivität. 2-CdA, ein Purinanalogon, zeigte bisher Aktivitäten als Einzelsubstanz in der Behandlung niedrigmaligner Lymphome. Chow et al untersuchten die Induktion der Apoptose durch die Einzelgabe von 2-CdA und durch 2-CdA in Kombination mit anderen antineoplastischen Medikamenten. Die Messungen der Apoptoserate (Durchflußzytometrie) induziert durch die alleinige Gabe von Cladribin, ergab eine von der Dosis abhängigen Kurvenverlaur 3x Mit Steigerung der Dosis erhöhte sich die Apoptoserate in den normalen wie in den neoplastischen Zellen. Hier wurde nun untersucht, ob sich durch die Steigerung der extrazellulären 2-CdA Konzentration, dessen intrazellulären Metabolismus erhöhen lässt und damit die Menge des aktiven Metaboliten 2-CdA TP. Als Methode eignete sich hierfür die HPLC. Die Ergebnisse zeigten, daß mit zunehmender extrazellulärer Konzentration die intrazelluläre Phosphorylierung des Cladribins in seine aktiven Metabolite signifikant anstieg. Es ist daher anzunehmen, daß höhere Dosen in vivo in der Behandlung niedrigmaligner Lymphome in einer größeren klinischen Effektivität resultieren könnte. Die klinische Effektivität könnte auch durch die Kombination mit anderen neoplastischen Substanzen erhöht werden. Untersucht wurde daher die Kombination von 2-CdA mit dem neuen Pyrimidinanalogon Gemcitabin (dFdC), welches bisher vielversprechende Aktivitäten gegenüber myeloischen und lymphatischen leukämischen Zellen gezeigt hat. Es wirkt dabei als Modulator auf den Metabolismus anderer Nukleoside, wenn diese durch die Deoxycytidinkinase phosphoryliert werden. Analysiert wurden unterschiedliche Inkubationsbedingungen (simultane und sequentielle Inkubation) an zwei myeloischen (Hel, HL 60) und an zwei lymphatischen (JURKAT, HUT 78) Zellinien. Der Einfluss von dFdC auf den intrazellulären Metabolismus des 2-CdA wurde mit Hilfe der HPLC untersucht. Es wurde beobachtet, daß eine simultane Applikation beider Substanzen zu einer antagonistischen Wirkung führte, während eine konsekutive Gabe einen synergistischen Effekt bewirkte, unabhängig von der Inkubationsdauer und dem Ursprung der Zellen (myeloisch oder lymphatisch). Die gewonnenen Daten legen nahe, daß eine gleichzeitige Kombinationstherapie von Cladribin und Gemcitabin nicht zu einer Verbesserung der klinischen Effektivität führt. In vielen Standardregimes werden Purin- und Pyrimidinanaloga zur Verbesserung der klinischen Effektivität miteinander kombiniert. Untersucht wurde bisher nur der Metabolismus der Standardtherapieschemata. Das Ziel dieser Arbeit bestand nun darin die Effektivität auf die Induktion der Apoptose, auf die Zellproliferation, auf den Zusammenbruch der Mitochondrienmembranpotentials und auf die Expression apoptoserelevanter Proteine zu analysieren. Die Hemmung der Zellproliferation und die Induktion der Apoptose sind die Hauptmechanismen der Zytotoxizität der antineoplastisch wirksamen Agenzien.65 Daher wurde hier analysiert, ob Ara-C in Kombination mit Purinanaloga einen synergistischen oder antagonistischen Effekt auf die Zellproliferation und auf die Induktion der Apoptose in AML Zellinien (HL 60 und HEL) ausübt. Daneben wurden die Effekte der Kombination von Ara-C mit Bendamustin, einem neuen bifunktionellen Agenz mit alkylierender Aktivität und mit den Eigenschaften der Purinanaloga, geprüft. Die Ergebnisse zeigen, daß Ara-C kombiniert mit Fludarabin oder Bendamustin sowohl zu antagonistischen Effekten auf die Hemmung der Zellproliferation, auf die Induktion der Apoptose als auch auf die Ruptur der Mitochondrienmembran führen, unabhängig von einer simultanen oder konsekutiven Applikation (Purinanaloga vor Ara-C), im Gegensatz zur Kombination von Cytarabin mit Cladribin. Während der Induktion der IC 50 Levels der Apoptose, konnte weder bei den antagonistischen noch bei den synergistischen Zytostatikakombinationen ein spezifisches Expressionsmuster der Apoptose assoziierten Proteine, wie der pro- oder antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitgliedern, der Exekutionscaspasen, der IAPs, des proapoptotischen PAR-4, PARP oder p53, beobachtet werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, daß die Effektivität der Medikamentenkombinationen Ara-C plus Purinanaloga abhängig ist von dem gewählten Purinanalogon, wohingegen die Inkubationsbedingungen (gleichzeitig oder sequentiell) oder die Dosiseskalation keine Rolle spielen.
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The purine analogues cladribine and fludarabine, as weil as the pyrimidine analogues cytarabine and gemcitabine are essential compounds in the treatment of Iymphoproliferative and hematologic diseases. Inhibition of cell
The purine analogues cladribine and fludarabine, as weil as the pyrimidine analogues cytarabine and gemcitabine are essential compounds in the treatment of Iymphoproliferative and hematologic diseases. Inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis are the major mechanisms of cytotoxic agents to cause tumor cell death. Several clinical trials demonstrated the clinical activity of nucleoside analogues. The rationale for the combination of established drugs with new drugs is the achievement of additive or synergistic effects resulting in an increased clinical efficacy. 2-CdA is active as a single agent in the treatment oflow-grade lymphomas.Chow et al analyzed the induction of apoptosis by 2-CdA alone and in combination with other drugs in peripheral Iymphocytes. They showed that cladribine as a single agent increased the rate of apoptosis in a dose dependent manner. Here the results were supported by HPLC analysis of the intracellular levels of 2-CdA nucleotides in relation to the escaleted dosages. The results showed, that the intracellular phosphorylation of cladribine did significantly increase in his active metabolites with increasing concentrations of the drug and increasing incubation time. lt seems reasonable to evaluate whether a lower dose of 2-CdA used in combination with other agents is able to achieve higher clinical efficacy than higher doses of cladribine as a single agent. Therefore, the combination of 2-CdA with the new pyrimidine analogue gemcitabine (dFdC) was tested. Gemcitabine demonstrated promising activity against human myeloid and lymphoid leukemic cells. lt is a modulator of the metabolism other nucleosides, which are phosphorylated by the deoxycytidine kinase. The combinaion of gemcitabine with cladribine in two myeloid (HEL, HL 60) and two Iymphatic (JURKAT, HUT 78) cell lines was investigated using different incubation conditions (simultaneous and consecutive). The influence of dFdC on the level of intracellular metabolites of 2-CdA was studied using the HPLC. The combination showed an antogonistic effect when both drugs applied simultaneously. This antagonism was reduced by consecutive application, independent from the incubation time and the cell line (myeloid or lymphoid). The data suggest that the simultaneous combination therapy with cladribine and gemcitabine may not improve the clinical efficacy. In several standardized regimes purine - and pyrimidine analogues are combined to improve the clinical efficacy. Therefore, I studied wh ether Ara-C in combination with the purine analogues exerts synergistic or antagonistic effects on cell proliferation, phosphatidylserine exposure and disruption of mitochondrial membrane potential (MMP) as weil as on the expression levels ofthe apoptosis-related proteins in the AML celliines HL 60 and HEL. Furthermore, effects of the combination of Ara-C with bendamustine, a new bifunctional agent with alkylating activity and a purine nucleus, was investigated. Assessement by combination index analysis showed that Ara-C combined with fludarabine or bendamustine exhibited additive to antagonistic effects in inhibition of cell proliteration, induction of apoptosis as weil as on disuption of mitochondrial membrane potential, independent of a simultaneous or consecutive (purine analogues before Ara-C) incubation shedule. In contrast, the combination of Ara-C with 2-CdA exclusively yielded synergistic effects. While inducing IC 50 levels of apoptosis neither the antagonistic nor the synergistic drug combinations caused a specific expression pattem of apoptosis-associated proteins such as the pro- or antiapoptotic BcI-2 family members, executioner caspases, IA Ps (inhibitor of apoptosis proteins), proapoptotic Par-4, PARP, or p53. In conclusion, here are demonstrated that the in vitro efficacy of drug combinations containing Ara-C and purine analogues depends on the purine analogue applied, whereas incubation schedules or escalating dosages do not contribute to the synergistic effects.
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Metadaten
Author:Simone Napieralski
URN:urn:nbn:de:hebis:30-71348
Referee:Paris S. Mitrou
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2009/10/01
Year of first Publication:2004
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2004/01/13
Release Date:2009/10/01
HeBIS PPN:217595529
Institutes:Medizin
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht

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