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Lotte Petra Hofmann

• Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide neben ihrer Funktion als Plasmamembranbestandteile auch als intra- und extrazelluläre Botenstoffe in zelluläre Signalwege eingreifen können. So haben das Lysosphingolipid S1P und sein Vorläufermolekül Ceramid wichtige regulatorische Funktionen in der Regulation von Zelltod- und wachstum. Dabei agiert Ceramid als proapoptotisches und wachstumshemmendes Lipid, während S1P zellprotektive und wachstumfördernde Funktionen in der Zelle hat und dadurch als „Gegenspieler“ von Ceramid wirkt. Durch die zwei Enzymklassen der Ceramidasen und Sphingosinkinasen wird in der Zelle ein sogenanntes „Sphingolipid-Gleichgewicht“ durch die stete Interkonvertierbarkeit der Lipide aufrechterhalten. Das zu einem bestimmten Zeitpunkt in seiner Konzentration dominierende Sphingolipid entscheidet so über das Schicksal der Zelle, ob es zum Zelltod oder zum Wachstum kommt. In dieser Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Sphingosinkinasen 1 und 2 bei Zellwachstum und Apoptose in Nierenmesangiumzellen untersucht. Dafür wurden aus SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Mäusen Mesangiumzellen isoliert. Obwohl beide Sphingosinkinasen dasselbe Produkt S1P generieren, zeigen die beiden „knock-out“-Zelllinien unterschiedliches Apoptose- und Wachstumsverhalten. In einem ersten Kapitel wurde gezeigt, dass eine Depletion der SK1 in einer Desensitivierung der Mesangiumzellen gegenüber dem apoptotischen Stimulus Staurosporin und in einer drastischen Wachstumsverlangsamung im Vergleich zu den Wt-Zellen resultierte. Im Gegensatz dazu führte eine Depletion der SK2 zu einem Schutz vor Apoptose und zu einer erhöhten Wachstumsrate. In einem zweiten Kapitel wurden mögliche molekulare Mechanismen untersucht, die für diese gegensätzlichen Zellantworten verantwortlich sind. Nachdem eine vermehrte Prozessierung der Caspase 3 in SK1(-/-)-Zellen und eine verminderte Prozessierung in SK2(-/-)- Zellen festgestellt wurde, ergaben weitere Westernblot-Analysen eine Beteiligung der beiden Signalkaskaden PKB/Bad sowie MEK/ERK1/2 im Apoptosemechanismus der Mausmesangiumzellen. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine verminderte Phosphorylierungsrate der involvierten Enzyme PKB, MEK1/2 und ERK1/2, wohingegen die Signalkaskaden von SK2(-/-) durch vermehrte Phosphorylierung dieser Kinasen konstitutiv aktiviert sind. Daneben scheint auch der antiapoptotische Faktor Bcl-xL am Vorgang der mesangialen Apoptose beteiligt. Eine Depletion der SK1 führt zu einer reduzierten Bcl-xL-Proteinexpression, wohingegen SK2(-/-)- Zellen eine drastisch erhöhte Expressionsrate dieses antiapoptotischen Faktors aufweisen. Als zentraler Regulator des Zellwachstums zeigt sich das Retinoblastoma-Protein (Rb) in den SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zellen antagonistisch reguliert. Während keine basale Phosphorylierung des Proteins in SK1(-/-)-Zellen gefunden werden konnte, ist Rb in SK2(-/-)-Zellen hyperphosphoryliert. Anschliessend konnte in SK1(-/-)- und SK2(-/-)-Zelle eine Beteiligung von weiteren zellzyklus-regulierenden Enzymen, die Rb-Protein vorgeschaltet sind, gefunden werden. So ist die cyklinabhängige Kinase CDK6 in hyperproliferierenden SK2(-/-)-Zellen auf Proteinebene vermehrt exprimiert. SK1(-/-)-Zellen zeigen eine erhöhte Proteinexpression des Zellzyklushemmers p27. In einem dritten Kapitel konnte gezeigt werden, dass eine Depletion der SK2 auch in Mausfibroblasten, die aus der Lunge von SK2(-/-)-Mäusen isoliert worden waren, zu einer vermehrten DNA-Synthese führt; die Funktion des Enzyms scheint also nicht zellspezifisch zu sein. Ein viertes Kapitel machte deutlich, dass Mausmesangiumzellen, die eine humane Variante der SK1 überexprimieren, vor stimulusinduzierter Apoptose geschützt sind. Darüberhinaus ist die DNA-Synthese der hSK1-transgenen Mausmesangiumzellen im Vergleich zu Wt- Zellen erhöht. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Sphingosinkinasen 1 und 2 in den primären Mausmesangiumzellen zelluläres Wachstum und Apoptose in entgegengesetzterweise regulieren: die SK1 wirkt mitogen und zellprotektiv, die SK2 hingegen wachstumshemmend und proapoptotisch
• In the last years it has become clear, that sphingolipids act as important intra- and extracellular messengers. Among these, sphingosine-1-phosphate (S1P) and its precursor ceramide are important regulators of important cell responses including cell growth and death. Whereas ceramide acts in a proapoptotic fashion and possesses inhibitory function in cellular growth, its “counteractor” S1P is a known mediator of cell survival and mitogenesis. An interconversion of these lipid mediators by enzymes such as ceramidases and sphingosine kinases 1 and 2 (SK1 and 2) creates a certain “sphingolipid-rheostat” in the cell determing wether a cell undergoes apoptosis or proliferates. This thesis mainly focuses on the influence of a depletion of SK1 and SK2 on the apoptotic and the proliferative machinery of primary cultures of murine mesangial cells. Although both subtypes generate the same product, namely S1P, their depletion results in an opposite outcome on cellular survival and growth. In a first chapter it could be demonstrated that a depletion of SK1 leads to a desensitization of the primary cultures of murine mesangial cells towards apoptotic stimuli and to a reduced DNA-synthesis, when compared to wildtype-cells. In contrast, SK2(-/-)-cells are rather protected against staurosporine treatment and show an enhanced cell cycle progression. In a second chapter, some possible underlying molecular mechanisms leading to impaired cellular survival and growth were investigated. In agreement with an increased apoptosis seen in SK1(-/-)-cells an increased processing and thus activation of the executioner Caspase 3 was detected. In contrast, apoptosis and the processing of Caspase 3 was decreased in SK2(-/-)-cells. Furthermore a reduced phosphorylation an thus activation of PKB/Akt and MEK was demonstrated in SK1(-/-)-cells. SK2(-/-)-cells however show constitutive active enzymes beeing hyperphosphorylated. Moreover, the antiapoptotic factor Bcl-xL seems to be involved in the apoptotic mechanism of murine mesangial cells. A depletion of SK1 leads to a reduction of Bcl-xL protein-expression, whereas SK2(-/-)-cells show a drastically increased expression of the antiapoptotic Bcl-xL protein. The Retinoblastoma protein (Rb) is a central regulator of cell cycle progression. We found that Rb protein is differentially regulated in SK1(-/-)-and SK2(-/-)-mouse mesangial cells. While no phosphorylation of Rb occurs under basal conditions in SK1(-/-)-cells, the protein can be found highly phosphorylated in SK2(-/-)-mesangial cells. Tracing Rb protein upstream, other cell cycle regulators could be found involved in the proliferative mechanism of SK1(-/-)- and SK2(-/-)-mesangial cells. CDK6 protein-expression is upregulated in response to a depletion of SK2. The expression of p27, a cell cycle inhibitor can be found elevated in SK1(-/-)-cells. In a third chapter, it could be demonstrated, that a depletion of SK2 in a primary culture of fibroblasts, isolated from SK2(-/-)-mice, also leads to enhanced DNA-Synthesis, suggesting that the observed effect of SK2-depletion, i.e. the increased DNA-synthesis is a more general phenomenon and not just a mesangial cell-specific effect. The fourth chapter revealed, that an overexpression of human SK1 in cultures of mesangial cells, isolated from hSK1-transgenic mice, leads to a protection of cells against stimulusinduced apoptosis and to an elevated DNA-synthesis. Alltogether these data have shown, that sphingosine kinase 1 and 2 regulate cellular growth and apoptosis in an opposite manner in primary cultures of murine mesangial cells: SK1 functions in a mitogenic and cell-protective way, SK2 in contrast inhibits cell growth and promotes apoptosis.