Mechanistische Untersuchungen zur Modulation der zytosolischen Phospholipase A2 durch Hyperforin

Mechanistical investigations of the modulation of cytosolic phospholipase A2 by hyperforin

Aus der Familie der Phospholipasen A2 nimmt die zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) in der Bereitstellung von Arachidonsäure (AA) für die Produktion von entzündungsfördernden Eikosanoiden und Lysophospholipiden eine Sc
Aus der Familie der Phospholipasen A2 nimmt die zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) in der Bereitstellung von Arachidonsäure (AA) für die Produktion von entzündungsfördernden Eikosanoiden und Lysophospholipiden eine Schlüsselrolle ein. Inwieweit die Modulation dieses Enzyms zum antientzündlichen Wirkspektrum von Hyperforin beiträgt, war Gegenstand dieser Arbeit. Hyperforin als Bestandteil des Johanniskrauts greift auf vielfältige Art und Weise in Entzündungsprozesse ein und hemmt unter anderem die Aktivität der 5-Lipoxygenase und Cyclooxygenase-1 in mikromolaren Konzentrationen. Zur Erforschung der cPLA2 als weitere potentielle Zielstruktur wurden die Effekte Hyperforins auf frisch isolierte humane polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) und Thrombozyten untersucht. Dabei ergaben sich erstaunlich widersprüchliche Ergebnisse. Während in PMNL die A23187- und Thapsigargin-induzierte AA-Freisetzung potent unterdrückt wurde (IC50 = 1,5 bis 1,9 µM), konnte Hyperforin die cPLA2-Aktivität in Thrombozyten nach A23187-Stimulation nicht und nach Thrombin-Induktion nur leicht beeinträchtigen. Hingegen resultierte aus der Behandlung von Thrombozyten mit 10 µM Hyperforin eine 2,6- bzw. 8,1-fache Steigerung der AA-Freisetzung und 12-Hydro(pero)xyeikosatetraensäure(H(P)ETE)-Produktion, die von einer Translokation der cPLA2 an die Plasmamembran begleitet war. In PMNL wurde eine Aktivierung der cPLA2 nicht beobachtet. Diese widersprüchlichen Befunde führten zu näheren mechanistischen Untersuchungen. Insbesondere der Einstrom von Ca2+, wie auch die Aktivierung von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) tragen in PMNL und Thrombozyten zur cPLA2-Aktivierung bei. Allerdings konnte eine Beeinträchtigung dieser Signaltransduktionswege durch Hyperforin ausgeschlossen werden. In PMNL wird der durch A23187- oder Thapsigargin-induzierte Ca2+-Einstrom nicht inhibiert und die Aktivierung der entsprechenden MAPK konnte durch Hyperforin (bis zu 10 µM) nicht vermindert werden. In Thrombozyten wurde die Translokation der cPLA2 sowie die AA- und 12-H(P)ETE-Produktion durch die Chelatierung von extra- und intrazellulärem Ca2+ nicht gehemmt. Auch die Unterbindung der Phosphorylierung der cPLA2 durch Hemmung der MAPK-Aktivierung konnte die Aktivierung der cPLA2 nicht verhindern. In zellfreien Untersuchungen an aufgereinigtem Enzym zeigte Hyperforin weder hemmende noch aktivierende Effekte, wenn Liposomen aus 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylcholin (PAPC) eingesetzt wurden. Nach Einbau von Dipalmitoylphosphatidylinositol-4,5-diphosphat, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol und Cholesterol in PAPC-Liposomen sowie gegenüber Lipid-Raft-Adaptionen (PAPC/Sphingomyelin/Cholesterol 1:1:1) zeigte Hyperforin allerdings inhibitorisches Potential (IC50 = 13,2 µM, 7,6 µM, 5,5 µM und 4,4 µM). Aktivierende Effekte des Hyperforins konnten in Abwesenheit von Ca2+ beobachtet werden, wenn cholesterolhaltige, Lipid-Raft-artige- oder 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylethanolamin(PAPE)-Vesikel eingesetzt wurden. 10 bis 30 µM Hyperforin erhöhten die AA-Freisetzung 3,3- bis 7,3-fach, wobei die Bindung des Enzyms an Liposomen mit Cholesterol und Lipid-Raft-Strukturen, aber nicht gegenüber dem PAPE-Substrat verstärkt war. Alle Effekte konnten durch die Zerstörung der Membranoberfläche und –struktur nach Zugabe von Triton-X-100 aufgehoben werden, wodurch die Bedeutung der Struktur der Lipidaggregate für die Hyperforinwirkung in den Vordergrund tritt. Darüber hinaus konnte die essentielle Rolle der vinylogen Carbonsäurestruktur des Hyperforins gezeigt werden, da ein O-Methylester des Hyperforins weder die Hemmung der cPLA2 in PMNL noch deren Aktivierung in Thrombozyten reproduzieren konnte und im Liposomenassay nur eine unspezifische Aktivierung der cPLA2 unabhängig von der Membranstruktur bewirkte. Neben der cPLA2-Aktivität wurde auch die Dichte der Liposomen abhängig von der Membranstruktur durch Hyperforin moduliert, allerdings konnten Änderungen der Membrandichte nicht mit Einflüssen auf die Enzymaktivität korreliert werden. Weiterhin wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Prof. Glaubitz, Universität Frankfurt, 1H-MAS-NMR-NOESY-Spektren von Liposomen aus 1-Palmitoyl(D31)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin mit integriertem Hyperforin aufgenommen. Das sich aus der Analyse der Spektren ergebende Modell postuliert die Lokalisation des sauerstoffreichen Bizyklus des Hyperforins im Kopfgruppenbereich der Lipide und eine Penetration der Isoprenylgruppen in die hydrophobe Schicht der Membranen. Die Ergebnisse dieser Arbeit in intakten Zellen und zellfreien Systemen verweisen somit auf komplexe Zusammenhänge, bei denen Interkalationen von Hyperforin mit speziellen Membranstrukturen im Vordergrund stehen. Die unspezifische Einlagerung der lipophilen Substanz Hyperforin in zelluläre Membrankompartimente könnte somit unter Umgehung der regulären Signaltransduktionswege zelltypabhängig die cPLA2-Aktivität modulieren.
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The cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) is a key enzyme in the liberation of arachidonic acid (AA) for the generation of eicosanoids and lysophospholipids. In this study the role of cPLA2 for the anti-inflammatory effects
The cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) is a key enzyme in the liberation of arachidonic acid (AA) for the generation of eicosanoids and lysophospholipids. In this study the role of cPLA2 for the anti-inflammatory effects of hyperforin is investigated. Hyperforin is an important and pharmacological relevant ingredient of St. John’s wart and inhibits inflammatory processes as the activation of 5-lipoxygenase and cyclooxygenase-1. Here, the influences of hyperforin on cPLA2 were studied in human polymorphonuclear leukocytes (PMNL) and platelets. The observed effects were contradictory and cell type specific. While hyperforin potently blocked the A23187- and thapsigargin-induced release of AA in PMNL (IC50 = 1.5 – 1.9 µM) it could not diminish the A23187-induced activation of cPLA2 in platelets and only slightly inhibit the release of AA from platelets challenged by thrombin. On the other hand, challenge of platelets by 10 µM hyperforin resulted in the translocation of cPLA2 to the plasma membrane, the release of AA and consequently the generation of 12-hydro(pero)xyeicosatetraenoic acid (12-H(P)ETE). Direct incubation of PMNL with hyperforin was without any effects. Activation of cPLA2 was reported to be addicted to alterations of the intracellular Ca2+-level as well as to the phosphorylation of cPLA2 by mitogen activated proteinkinases (MAPK). However, effects of hyperforin were found to be independent on these intracellular signaling pathways. As reported, hyperforin fails to inhibit A23187- and thapsigargin-induced Ca2+ influx in PMNL and furthermore hyperforin up to 10 µM could not diminish the activation of relevant MAPK in those cells. In platelets deletion of extra- and intracellular Ca2+ as well as the inhibiton of MAPK and thereby the prevention of phosphorylation of cPLA2 could not inhibit the hyperforin induced effects on the translocation of cPLA2 as well as the release of AA and 12-H(P)ETE. In cell free investigations hyperforin failed to alter the release of AA from liposomes of 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PAPC). However, if dipalmitoylphosphatidylinositol-4,5-diphosphat, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol or cholesterol were integrated into PAPC-liposomes or if liposomes with lipid raft structures were constructed (PAPC/sphingomyelin/cholestero 1:1:1) hyperforin inhibited the activity of cPLA2 (IC50 = 13.2 µM, 7.6 µM, 5.5 µM and 4.4 µM) in the presence of Ca2+. In the absence of Ca2+ hyperforin increased the release of AA from PAPC-liposomes with cholesterol, liposomes with lipid raft structures and liposomes of 1-plamitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamin (PAPE) 3.3 to 7.3fold. Further, hyperforin enhanced the binding of cPLA2 to liposomes with cholesterol or lipid raft structures but not to vesicles of PAPE. The observed effects could not be reproduced in triton-X-100 micelles, indicating the importance of specific membrane structures for the effects of hyperforin. Additionally, the vinylogous carbonic acid structure of hyperforin was found to be essential. O-Methylhyperforin failed to inhibit the release of AA from PMNL and to enhance the activity of cPLA2 in platelets and induced an unspecific activation of cPLA2 in cell free investigations that was independent on the composition of membranes. Beside cPLA2 activity hyperforin further modulated the rigidity of liposomes dependent on the composition of the lipid aggregates. However, no correlation between the effects of hyperforin on membrane rigidity and enzyme activity could be drawn. In cooperation with the group of Prof. Glaubitz, university of Frankfurt, the incorporation of hyperforin in liposomes of 1-palmitoyl(D31)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin was studied by 1H-MAS-NMR-NOESY. This way the oxygen rich bicyclus of hyperforin was found to locate near the phospholipid headgroups of lipids while the isoprenyl groups penetrated into the hydrophobic core of the bilayer. Taken together, the results of this work in intact cells and cell free assays indicate a complex way of mechanisms of hyperforin which differentially modulates cPLA2 activity in PMNL and platelets independently on intracellular signalling pathways or direct enzyme regulation. Rather, the unspecific insertion of hyperforin into phoshpolipid bilayers of specific structures results in alterations of the activity of cPLA2 and may be responsible for the observed modulation of AA release in PMNL and platelets.
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Metadaten
Author:Marika Hoffmann
URN:urn:nbn:de:hebis:30-73260
Referee:Dieter Steinhilber
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/01/12
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2009/12/07
Release Date:2010/01/12
Tag:biomembranes; cytosolic Phospholipase A2 ; hyperforin ; platelets ; polymorphnuclear leukocytes
SWD-Keyword:Biomembran; Granulozyt ; Hyperforin ; Phospholipase A2 ; Thrombozyt
HeBIS PPN:219528810
Institutes:Pharmazie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht

$Rev: 11761 $