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Daniel Schwarz

• Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einem potenten Werkzeug – auch in der Produktion von Membranproteinen – entwickelt. Da keine lebenden Zellen genutzt werden, kann der Prozess der präparativen Membranproteinproduktion vereinfacht und individuell optimiert werden. Im Gegensatz zu konventionellen zellbasierten Expressionssystemen gewährleistet die zellfreie Proteinsynthese die direkte Zugänglichkeit zum Reaktionsort und damit die Möglichkeit der unmittelbaren Kontrolle. Dies ermöglicht eine genaue Anpassung der Reaktionsbedingungen auf das Zielprotein. Die Verbesserung und Entwicklung neuer Modi der zellfreien Membranproteinsynthese war ein Teil der vorliegenden Arbeit. Setzt man dem Zellfrei-System von Außen keine hydrophobe Umgebung zu, so präzipitiert das neu-synthetisierte Membranprotein im Reaktionsmix (P-CF). Interessanter Weise unterscheiden sich diese Präzipitate von den aus der E.coli zellbasierten Proteinproduktion bekannten Einschlußkörperchen, da sie sich teilweise leicht in mildem Detergenz resolubilisieren lassen. Zudem konnte für verschiedene Transportproteine, die aus Präzpitat resolubilisiert und danach in Liposomen rekonstituiert wurden, spezifische Transportaktivität gezeigt werden (z.B. eukaryotische Ionentransporter, Multi-Drug Resistenzproteine von E.coli). Alternativ können die Membranproteine direkt, durch die Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsmix, solubilisiert werden (D-CF). Um die einzelnen Expressionsmodi zu optimieren wurden 24 gebräuchliche Detergenzien auf ihre Eigenschaft hin gestestet, strukturell sehr unterschiedliche Membranproteine zu solubilisieren. Die Familie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether hat sich dabei als sehr geeignet erwiesen um das prokaryotische α-helikale Multi-Drug Resistenzprotein EmrE, den bakteriellen vornehmlich aus ß-sheets bestehenden Transporter Tsx und den eukaryotischen G-Protein gekoppelten Vasopressin Rezeptor V2R direkt im D-CF Modus zu solubilisieren. Zudem konnte eine Abhängigkeit der spezifischen Aktivität von Tsx vom verwendeten Expressionsmodus bzw. des verwendeten Detergenz mit Hilfe der Black Lipid Membrane´ Methode gezeigt werden. Die Expression eines repäsentativen Teils von 134 Zielproteinen des inneren Membranproteoms von E.coli wurde in drei verschiedenen Zellfrei-Expressionsmodi getestet. Ein an jedes Zielprotein des Membranroteoms C-terminal fusioniertes GFP diente der Konzentrationsbestimmung im D-CF Expressionsmodus. Die Faltung von GFP ist in Anwesenheit von Detergenz signifikant reduziert. Zunächst wurden alle Zielproteine in einem batch´ System im D-CF Modus im Mikrotiterplatten Maßstab mit Hilfe eines Roboters hergestellt. Die Etablierung einer robotergestützten Plattform, welche das Pipettieren, Inkubieren und Detektieren kombiniert, diente als Grundlage für den Herstellungsprozess des Membranroteoms von E.coli in einem Medium-Durchsatz Verfahren in batch´ Konfiguration. In dieser ersten Stufe des Screens im D-CF Modus konnten 84 Zielproteine (63%) aufgrund der detektierten GFP-Fluoreszens in Mengen von 1 bis 60μg pro mL Reaktion als erfolgreich produziert identifiziert werden. Zudem wurde das Membranproteom in dem effektiveren continous exchange (CE) Verfahren im P-CF, wie auch im D-CF Modus wiederholt exprimiert. Im Vergleich zur batch´ Konfiguration konnten im CE D-CF Modus deutlich mehr Zielproteine (75%) als positiv identifiziert werden. 16 Zielproteine wurden dabei bereits in Expressionsmengen von mehr als 100μg solubilisierte Membranproteinfusion pro mL Reaktionsmix gewonnen. 99 Zielproteine (74%) konnten als positiv identifiziert werden, nachdem die unlösliche Fraktion der CE P-CF Reaktion elektrophoretisch getrennt und angefärbt wurde. Für 66 Kandidaten (49%) stellt das produzierte Protein nach Coomassie-Färbung eine dominante Bande, und damit (semi-)präparative Proteinmengen, dar. Der Erhalt von Detergenz-solubilisierten Membranproteinproben von hoher Qualität ist ein wichtiger Schritt zur Gewinnung struktureller sowie biochemischer Daten. Das E.coli α-helikale Multi- Drug Resistenz Protein SugE konnte im CE P-CF Verfahren in präparativen Mengen von mehr als 2mg Protein pro mL des Reaktionsansatzes gewonnen werden. Durchgeführte analytische Größenausschlusschromatographie zeigte, dass der Transporter unter optimierten Reaktionsbedingungen in einem homogenen, schlanken Peak eluiert. Mittels elektronenmikroskopischer Gefrierbruchanalysen konnte eine effiziente und homogene Rekonstitution von SugE in E.coli Liposomen gezeigt werden. Bindungsstudien unter der Verwendung fluoreszensbasierter Anisotropie-Messungen haben gezeigt dass Proflavin – im Gegenteil zu Ethidium – ein Substrat von SugE ist. YedZ ist ein 24kDa leucinreiches Membranprotein mit sechs putativen Transmembransegmenten und enthält zwei Kofaktoren, ein Häm b und ein Flavin-mononukleotid (FMN). Im P-CF Modus exprimiertes YedZ kann effizient in den Detergenzien LMPG, LPPG, SDS und DPC resolubilisiert werden. Analytische Größenausschlusschromatographie zeigte einen symmetrischen Elutionspeak der apo-Form. Mittels CD-Spektroskopie des gereinigten apo-YedZ in 0.02% DDM wurde ein α-helikaler Sekundärstrukturanteil von 55% ermittelt. Zur Gewinnung von holo-YedZ wurde anstatt Hämb das chemisch verwandte Hemin eingesetzt. Die aufgenommenen UV/Vis Spektren der zellfrei produzierten holo-YedZ Proteinprobe in ihrer oxydierten und reduzierten Form, zeigen zu einer in vivo exprimierten Vergleichsprobe identische Absorptionsmaxima. Für sechs G-Protein gekoppelten Rezeptoren konnte die zellfreie Expression in präparativen Mengen gezeigt werden. Das Steroid-Derivat Digitonin, sowie einzelne Mitglieder der Detergenzfamilie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether, wurden als am geeignetsten für die lösliche Expression der GPCRs im CE D-CF Verfahren ermittelt. Löslich in Anwesenheit von Brij78 produzierter GPCR Proben, zeigten nach Negativfärbung in elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalysen eine homogene Probenpräparation und geben Hinweis auf eine strukturelle Dimerisierug der Rezeptoren. Detergenzsolubilisierte Rezeptoren konnten in Liposomen, basierend auf E.coli Lipid-Mischungen, rekonstituiert werden. Elektronen-mikroskopische Gefrierbruchanalysen zeigten eine homogene Rekonstitution, welche auf eine funktionelle Faltung der Rezeptoren schließen lässt.
• Membrane proteins (MPs) define the link between physiological pathways in the cytoplasm and the cellular environment. Essential processes like perception and transduction of external signals, import or export of substances through the membrane or the generation of energy is associated with MPs. So, many modern drugs are directed against MPs and this class of proteins– is therefore an important target for medical and pharmaceutical research. However, high resolution structures of MPs are still the very exception. A major bottleneck for structural analysis is the limited availability of sufficient amounts of protein samples. Cell-free (CF) expression systems have emerged in recent times as promising tools in order to accelerate and to streamline MP expression approaches. The elimination of a living host environment during protein overexpression in combination with the open accessibility of the reaction offers a variety of valuable advantages. First, improvements in developing new or modified CF-expression modes have been one task of this thesis. If no hydrophobic compartment is provided, the MPs precipitate in the reaction mixture (PCF). Interestingly, these insoluble proteins are found to differ from inclusion bodies as they readily solubilize in mild detergents and can be reconstituted into liposomes in an active form, as shown e.g. for the eukaryotic ion-transporters rOCT1, rOCT2 and rOAT1 or the small multidrug resistance protein SugE from E.coli. Alternatively, IMPs can be synthesized in a soluble mode by supplementing the CF system with detergents (D-CF). A comprehensive overview of 24 commonly used detergents was provided by analyzing their impact on the CF system as well as their ability to keep three structurally very different proteins in solution. The class of long chain polyoxyethylene-alkyl-ethers turned out to be most suitable for soluble expression of α-helical small-multidrug resistance protein EmrE, the bacterial β-barrel type nucleoside transporter Tsx and the porcine vasopressin receptor type 2, resulting in up to several mg of protein per mL of reaction mixture. Finally a clear dependence of recovering the specific activity of the nucleoside transporter Tsx on the applied mode of CFexpression and/or used kind of detergent could be demonstrated in Black Lipid Membrane assays. Second, a representative subset of 134 targets of the inner membrane proteome of E.coli was screened in three CF expression configurations. These targets were mainly assigned to be involved in transport processes (59%), more than 60% of the MPs are composed of >300 amino acids and more than 75% contained >4 proposed transmembrane segements. Initially all targets were expressed in CF batch configuration and the reactions were performed in the D-CF mode in microplates by a robotic device. At this first level the general expressability of the targets in a medium-throughput screening approach was tested. In the subsequent level 2, the more productive continous-exchange (CE) configuration in combination with the D-CF mode as well as the P-CF mode of expression was used. In this level, the production yield of the targets was determined and the efficiency of detergent solubilization was evaluated. In the final level 3, selected MP targets were produced in in preparative scales in different conditions and the sample quality was analyzed. A C-terminal GFP tag was used to monitor expression levels of the membrane proteome of E.coli in D-CF mode. GFP folding is significantly reduced in presence of detergents, only the group of polyoxyethylene-alkyl-ethers allowed to some extend GFP folding, while in parallel sufficient MP solubilization efficiencies could be shown. The implementation of a robotic device with an integrated pipetting, incubation and detection platform facilitated the throughput purpose. In this first screen using batch-D-CF reactions in presence of Brij-78, the expression of a total of 84 MPs representing 63% of all targets could be detected by GFP fluorescence. The calculated production levels based on GFP fluorescence were ranging in between 1-60 μg/mL of a reaction in batch configuration. Repeating the screen with the more productive CE D-CF configuration, the synthesis of a significant higher number of 101 targets representing 75% and covering almost all positive targets from the previous batch-D-CF screen were detected. 16 targets were obtained in production yields of >100μg/mL of soluble MP-GFP protein. Some targets that are poorly or even not at all detectable in the D-CF mode of expression might still become synthesized but could fail to solubilize in Brij-78. In addition, the expression efficiencies of the targets in the P-CF mode could be different if compared with the D-CF mode. Therefore the subset of the membrane proteome was additionally produced in a CE P-CF format. In general, the expression of 99 targets representing a total of 74% could be detected in the CE P-CF reactions. A number of 66 targets representing 49% of the complete library were detectable as dominant band by Coomassie-Blue staining after SDS-PAGE. To obtain solubilized protein samples is essential for MP production and thus the efficiency of detergent solubilization and the resulting sample quality of few representative larger MPs was analysed. The 44 kDa ammonia transport channel AmtB, the 54 kDa proline transporter PutP and the 41 kDa Na+ : H+ exchanger NhaA containing 12 predicted TMSs each as well as the 114 kDa putative multidrug efflux pump YegN (MdtB) containing 11 predicted TMSs were selected as models. The soluble expression of the MPs was first analysed in the CE D-CF mode in presence of different detergents. Brij-35, Brij-58, Brij-78 and Brij-98 were most effective to solubilize all four MPs. The resolubilization of the CE P-CF produced MPs was further evaluated with various detergents including SDS, LMPC, LMPG, LPPG, DPC and SB3-14 in concentration ranges between 0.125% and 1%. Immunoblotting against the terminal poly(His)10-tag verified the full-length expression of all targets and evidence of putative dimer (AmtB, NhaA, PutP) and trimer (AmtB) formations was observed. A preliminary evaluation of the isolated MP sample qualities was done by analytical size exclusion chromatography (SEC) and the molecular masses of the detected proteomicelles in the elution profiles were determined according to standards. The α-helical small-multidrug resistance protein SugE of E.coli could be produced in high levels of up to 3mg per single mL of reaction in P-CF mode. Obtained SugE can be directly solubilized in ß-OG, TX100 and DDM and shows narrow peaks when analyzed by SEC. D-CF in presence of Brij78 produced transporter could be purified to homogeneity and gave evidence of dimer formation when analyzed by gelfiltration. Efficient reconstitution of SugE into liposomes was revealed by freeze fracture electron microscopy and homogenously dispersed particles gave evidence for functional folding. In difference to the small-multidrug resistance protein EmrE, which is very closely related to SugE, no specific ethidium translocation could be observed in fluorescence based transport assay. Using fluorescence anisotropy measurements it was shown that ethidium is not even bound by reconstituted SugE. Proflavin was found to interact with into E.coli liposomes reconstituted SugE and the KD-value of the binding was determined to ~18μM. YedZ is a 24 kDa leucine rich integral MP with six putative TMSs and is reported to bind two cofactors, heme b and flavin mononucleotide (FMN). P-CF produced YedZ can efficiently be resolubilized in LMPG, LPPG, SDS and DPC. Highly pure apo-YedZ in yields of approx. 1.2 mg/mL of reaction could be obtained by solubilization in LPPG, purification on a Ni2+-chelate column and elution in DDM. SEC of this sample resulted in symmetrical Gaussian shaped peaks indicating for non-aggregated protein. CD spectroscopy of purified apo-YedZ in 0.02% DDM indicated an α-helical content of 55%. To synthesize holo-YedZ the closely to heme b related hemin was used. Co-factor incorporation efficiency was quantified by determining the ratio of protein to co-factor absorbance, revealed by SEC and UV/Vis spectroscopy. High incorporation rates in com bination with homogenous sample quality could be obtained if CE P-CF produced apo-YedZ was solubilized in LPPG and the detergent was subsequently exchanged with DDM upon binding of the protein to a Ni2+ chelate column. The obtained UV/Vis spectra of the CF produced holo-YedZ in its oxydized and reduced forms correspond to recorded spectra of the heme b containing YedZ purified after in vivo expression in E. coli. The G-protein coupled receptors (GPCRs) human melatonin 1B receptor (MTN), the human vasopressin type 2 receptors (V2R), the human neuropeptide Y4 receptor (NPY), the human dopamine 1 receptor (D1) and the rat corticotropin releasing factor receptor (CRF1) were analysed by cell-free expression. All receptors could be produced in preparative amounts (>1mg/mL) in P-CF mode and the resolubilization in LMPG was almost quantitatively. Solubilized GPCRs could be reconstituted into liposomes based on E.coli lipid mixtures and freeze fracture electron micrographs revealed homogenously dispersed particles, which gave evidence for functional folding. The steroid detergent digitonin and the polyoxyethylene derivatives Brij35, Brij58 and Brij78 have been identified to be most suitable for the soluble CF expression of the GPCRs. Electron micrographs of negatively stained D-CF produced and affinity purified V2R and CRF1 particles exhibit homogenous and mono-disperse bilobed structures, indicating high sample quality.