Analyse der Mechanismen der Hemmung des humanen LINE-1-Retrotransposons durch die Cytidindeaminasen APOBEC3A und APOBEC3C

Analysing the inhibiting mechanisms of human LINE-1 retrotransposons by the cytidine deaminases APOBEC3A and APOBEC3C

LINE-1-Retrotransposons sind für die Entstehung von über 35 % des menschlichen Genoms verantwortlich. Während ihre Aktivität entscheidend zur Evolution von Säugetieren allgemein und des Menschen im Speziellen beigetragen
LINE-1-Retrotransposons sind für die Entstehung von über 35 % des menschlichen Genoms verantwortlich. Während ihre Aktivität entscheidend zur Evolution von Säugetieren allgemein und des Menschen im Speziellen beigetragen hat, kann die L1-Expression und die L1-vermittelte Retrotransposition schädigende Auswirkungen für die Wirtszelle haben (Goodier und Kazazian, 2008). Die Liste der dokumentierten, durch L1-Aktivität hervorgerufenen Erkrankungen umfasst gegenwärtig ca. 65 Fälle von genetischen bzw. Tumorerkrankungen und wird immer länger. Um die Anzahl schädigender L1-Retrotranspositionsereignisse zu minimieren, hat der menschliche Organismus Strategien entwickelt, um die L1-Retrotransposition zu kontrollieren. Eine dieser Strategien ist die Inhibition der L1-Aktivität durch Mitglieder der APOBEC-Proteinfamilie, wobei deren jeweilige Mechanismen der L1-Inhibition gegenwärtig noch nicht aufgeklärt sind. Es war daher das Ziel dieser Arbeit, Einblicke in die Mechanismen der Hemmung der L1-Retrotransposition durch Mitglieder der Familie der humanen APOBEC3-Proteine zu bekommen, wobei eine Fokussierung auf den durch APOBEC3C vermittelten Mechanismus vorgenommen wurde. Aufbauend auf kürzlich publizierte Daten zur Hemmung der L1-Retrotransposition durch die APOBEC3-Proteine A3A, A3B, A3C und A3F (Bogerd et al., 2006; Chen et al., 2006; Muckenfuss et al., 2006) wurde eine Arbeitshypothese entwickelt, welche die L1-Inhibition durch APOBEC3-vermittelte Deaminierung von Cytosinen der L1-cDNA unter der Beteiligung von Faktoren des „Base Excision Repair“-Weges erklärt. Diese Arbeitshypothese steht im Einklang mit der Abwesenheit nachweisbarer G-zu-A-Hypermutationen von L1-Kopien wie sie für die APOBEC3-spezifische Deaminaseaktivität charakteristisch sind, sowie mit der Existenz 5’-verkürzter genomischer L1-Kopien. Die Ergebnisse aus in silico-Analysen der 5’-Enden von 38 L1-Neuinsertionen aus Zellkulturexperimenten, die in Anwesenheit von endogen exprimiertem A3B, A3C und A3H retrotransponiert waren, sowie von 885 genomischen, endogenen L1-Kopien waren in Übereinstimmung mit unserer Arbeitshypothese, da in beiden Fällen Guanin als erste fehlende L1-Nukleobase am L1-5’-Ende statistisch signifikant überrepräsentiert vorliegt. Während für die Inhibition von L1 durch A3A dessen Deaminaseaktivität notwendig ist, wurde gezeigt, dass A3C die L1-Retrotransposition über einen deaminaseunabhängigen Mechanismus hemmt. Die L1-Inhibition durch A3C erforderte sowohl eine funktionelle Dimerisierungsdomäne als auch eine intakte RNA-Bindedomäne. Die Identifizierung von A3C und L1-ORF1p in derselben Saccharosegradientenfraktion sowie die Kolokalisation beider Proteine im Zytoplasma von HeLa- bzw. 143B-Zellen sprechen für eine Interaktion von A3C mit L1-ORF1p bzw. L1-RNPs. Da eine direkte Interaktion von A3C und L1-ORF1p mittels Immunopräzipitation nicht nachgewiesen werden konnte, spricht dies dafür, dass die Interaktion nicht auf einen direkten Kontakt zwischen A3C und L1-ORF1p beruht. Eine direkte Interaktion zwischen A3A und L1-ORF1p konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Vielmehr spricht die Abhängigkeit der A3C-vermittelten Hemmung von der intakten RNA-Bindedomäne, experimentelle Daten, welche eine Interaktion mit L1-RNPs vorschlagen, sowie die Kolokalisation von A3C und L1-ORF1p im Zytoplasma für eine Sequestrierung der L1-RNPs, die Behinderung des nukleären Imports der L1-RNPs oder aber eine Blockierung der TPRT-Initiation als mögliche Mechanismen der A3C-vermittelten Hemmung der L1-Retrotransposition.
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About 17 % of the human genome are covered by copies of the Long Interspersed Element 1 (LINE-1, L1) which is a proliferating autonomous non-LTR retrotransposon. Mobilization of L1 elements affects the host genome, can b
About 17 % of the human genome are covered by copies of the Long Interspersed Element 1 (LINE-1, L1) which is a proliferating autonomous non-LTR retrotransposon. Mobilization of L1 elements affects the host genome, can be deleterious to the host cell, and cause genetic disorders and cancer. It was shown that members of the human APOBEC3 (A3) protein family of cytidine deaminases (CDAs) participate in the intracellular defence against retrotransposition and inhibit L1 retrotransposition by 35-95% by mechanisms unknown to date. Since genomic L1 retrotransposition events that occurred in the presence of L1-inhibiting A3 proteins are devoid of detectable G-to-A hypermutations that are typical of A3-mediated cytidine deamination, we initially developed a model that would explain the absence of G-to-A hypermutations despite L1 inhibition by cytidine deamination. In this model, the host-encoded ‘base excision repair’ pathway is involved, and it was confirmed by in silico analyses of the 5’ junctions of 5’-truncated L1 insertion. Subsequently, we set out to uncover the mechanisms of L1 inhibition mediated by APOBEC3A (A3A) and APOBEC3C (A3C) which are both characterized by one single cytidine deaminase domain. Testing the L1-inhibiting effect of various A3A and A3C CDA mutant proteins in L1 retrotransposition reporter assays uncovered that A3A-mediated L1 inhibition is dependent on CDA activity, while A3C-mediated L1 inhibition is deaminase-independent. Further mutational analysis uncovered that A3C-mediated L1 inhibition requires both an intact RNA binding pocket domain and an intact dimerization site, indicating that an interaction between A3C dimers and RNA is essential for L1 inhibition. The localization of L1 ORF1p and A3C in the same fraction after density gradient centrifugation of L1-RNPs suggests an interaction between A3C and L1 RNPs. This is supported by the colocalization of A3C and L1-ORF1p in cytoplasmic foci of human 143B osteosarcoma cells. Our studies show that the single deaminase-domain A3 proteins A3A and A3C restrict human L1 retrotransposition by diverse mechanisms. Inhibition of L1 retrotransposition by A3A is CDA-dependent which is consistent with our model explaining the absence of detectable G-to-A hypermutations despite cytidine deamination. A3C-mediated L1 inhibition does not require CDA activity. Dimerized A3C proteins might restrict L1 activity by interacting with L1 RNPs via L1 RNA which could result in the segregation of L1 RNPs.
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Metadaten
Author:Axel Volker Horn
URN:urn:nbn:de:hebis:30-77492
Referee:Rolf Marschalek
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/06/01
Year of first Publication:2009
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2010/05/12
Release Date:2010/06/01
Tag:APOBEC ; Cytidindeaminase ; LINE-1
APOBEC ; LINE-1; cytidine deaminase
SWD-Keyword:Repetitive DNS; Retrotransposon ; Transponierbares Element
HeBIS PPN:223718602
Institutes:Pharmazie
Dewey Decimal Classification:540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

$Rev: 11761 $