Funktionelle Analyse von retroviralen SIN Vektoren in T-Zellen

Für eine erfolgreiche Gentherapie ist zunächst ein effizientes Gentransfersystem nötig, das das Transgen in möglichst vielen Zellen einbaut und es aktiv hält. Damit sich dann der Anteil der geschützten Zellen vergrößert,
Für eine erfolgreiche Gentherapie ist zunächst ein effizientes Gentransfersystem nötig, das das Transgen in möglichst vielen Zellen einbaut und es aktiv hält. Damit sich dann der Anteil der geschützten Zellen vergrößert, muss eine Selektivität der genmodifizierten Zellen gegenüber den nativen Zellen gegeben sein, wobei die Sicherheit nicht außer Acht gelassen werden darf, da ein ungünstiger Einbau des Transgens eine Insertionsmutagenese und somit Tumoren induzieren kann. Der durch die Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o codiert den membranständigen Fusionsinhibitor maC46 (membran-anchored C-Peptid 46), der den Eintritt von HIV (Human Immunodeficiency Virus) in die Zielzelle effektiv verhindert. Diese Gentherapie mit M87o wurde in einer klinischen Studie an T-Lymphozyten von 10 weit fortgeschrittenen AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)-Patienten durchgeführt, wobei die Therapie gut verträglich war und keine Toxizität zeigte. Allerdings hatten die Patienten auch keinen klaren Vorteil von der Therapie. In der vorliegenden Arbeit wurden SIN Vektoren (Self-inactivating Vektoren) in 5 verschiedenen Konstruktionen getestet, um die optimale Vektordesign zu ermitteln und eine langfristige hohe Expression zu ermöglichen. Da die SIN Vektoren im Vergleich zu konventionellen gammaretroviralen Vektoren ein geringeres Risiko bezüglich der Insertionsmutagenese aufweisen, stellen sie ein sichereres Vektorsystem dar. Um eine bessere Transgenexpression zu erzielen, wurde in den SIN Vektoren entweder ein zellulärer Promotor oder ein viraler SFFV (spleen focus forming virus) als internen Promotor verwendet. Zusätzliche regulatorische Elemente, wie wPRE (Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element), cHS4 (chicken Hypersensitive Site) Insulator und SAR (Scaffold Attachment Region) Element wurden dann in unterschiedlichen Kombinationen zu stärkeren und langanhaltenden Expressionen integriert, wobei wPRE die RNA Prozessierung verbessert und somit die RNA Stabilität erhöht und SAR und cHS4 Insulator dem Silencing entgegenwirken und so die Expression aufrechterhalten. Diese fünf SIN Konfigurationen wurden untereinander und mit dem klassischen gammaretroviralen Vektor M87o bezüglich des Titers, der Expressionsstärke und der Langzeit-Genexpression verglichen. Dazu wurden zunächst humane T-Zelllinien PM-1 und primäre humane T-Zellen als Testzellen verwendet. Die Versuche wurden dann mit murinen T-Zellen wiederholt, die in die immundefiziten Mäuse transplantiert wurden, um die Genexpression in vivo weiter zu verfolgen. Die SIN Konstrukte zeigten jedoch eine deutlich schwächere Expression als die LTR (Long Terminal Repeat)-getriebene Vektoren und nur ein Konstrukt mit dem viralen Promotor und wPRE zeigte eine annähernd so hohe Expression wie die konventionellen Vektoren. Während der virale SFFV Promotor eine höhere Expressionsstärke gegenüber dem zellulären EF1α (Elongationsfaktor 1 alpha) Promotor zeigte, hatte der cHS4 Insulator nur geringfügige Einflüsse sowohl auf den Titer als auch auf die Expressionsstärke. Der Vektor mit dem SAR-Element zeigte zwar die geringsten Titer und Expressionsstärke, aber in Langzeitbeobachtung wies er sowohl in vitro als auch in vivo eine relativ konstante Anzahl von transgenpositiven Zellen auf. SIN Vektoren, in denen mit einer Kombination von wPRE und SAR-Element die RNA Prozessierung verbessert und das methylationsbedingte Silencing verhindert wird, könnten eine weitere Optimierungsmöglichkeit des Gentransfersystems bei der Gentherapie darstellen.
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In order to achieve a successful gene therapy, the transgene has to be integrated in as many cells as possible and kept active by an efficient gene transfer system. Furthermore there has to be a selective advantage of ge
In order to achieve a successful gene therapy, the transgene has to be integrated in as many cells as possible and kept active by an efficient gene transfer system. Furthermore there has to be a selective advantage of gene-modified cells compared to native cells to augment the percentage of protected cells. At the same time the safety cannot be disregarded, since an adverse integration of a transgene may lead to insertional mutagenesis and thereby induce tumors. The vector M87o developed in the workgroup of Dorothee von Laer encodes a membrane anchored fusion inhibitor maC46 (membrane anchored C-Peptide 46), which effectively inhibits the entry of HIV (human immunodeficiency virus) into target cells. This gene therapy with M87o has passed a clinical trial with T lymphocytes of 10 patients with advanced AIDS (acquired immune deficiency syndrome). The therapy was safe and no toxicity was observed in the patients. However, the therapy had no significant benefit for the patients. In this study SIN vectors (self inactivating vectors) were tested in 5 different configurations, in order to find the optimal vector design for a gene therapy with maC46 and enable a high long-term expression of retroviral SIN vectors in T lymphocytes. SIN vectors are regarded as a safer vector system due to the lower risk of insertional mutagenesis compared to conventional gamma retroviral vectors. To obtain better transgene expression, SIN vectors have either a cellular promoter or a viral SFFV (spleen focus forming virus) promoter as an internal promoter. In addition, regulatory elements like wPRE (woodchuck posttranscriptional regulatory element), cHS4 (chicken Hypersensitive site) insulator and SAR (scaffold attachment region) element were integrated into some of the vectors. These elements should lead to a higher and a long-lasting transgene expression. wPRE improves RNA processing and stability, whereas SAR and cHS4 insulator counteract the silencing of transgene and maintain the expression. These 5 SIN vectors were compared to each other and to the conventional gamma retroviral vector M87o in terms of titers, expression rate and long term gene expression. For this propose, the human T cell line PM-1 and primary human T cells were used as test cells. The experiments were then repeated with murine T cells, which were later transplanted into immune deficient mice to follow the gene expression in vivo. The SIN vectors showed significantly weaker transgene expression than LTR (long terminal repeat) driven vectors and only one combination with the viral promoter and wPRE showed an expression nearly as high as for the M87o vector. While the viral SFFV promoter had higher expression rate than cellular EF1α (Elongation factor 1 alpha) promoter, cHS4 insulator only minimally affected titer and expression rate. The vector with SAR element had the lowest titer and expression rate, but held a relatively constant amount of transgene positive cells in the long term experiment. SIN Vectors, in which RNA processing is improved and methylation dependant silencing is inhibited with a combination of wPRE and SAR element, may be a further possibility of optimization of gene transfer system for the gene therapy.
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Metadaten
Author:So Young Ryou
URN:urn:nbn:de:hebis:30-77689
Referee:Dorothee von Laer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2010/06/02
Year of first Publication:2010
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Date of final exam:2010/04/20
Release Date:2010/06/02
HeBIS PPN:223950408
Institutes:Medizin
Georg-Speyer-Haus
Dewey Decimal Classification:610 Medizin und Gesundheit
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License Logo Veröffentlichungsvertrag für Publikationen

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