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Sandra Bornemann

• Als Teil der Atmungskette des hyperthermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus besteht die NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase aus 13 Untereinheiten, die durch 24 unterschiedliche Gene codiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für den massenspektrometrischen Nachweis dieser Untereinheiten nach der Aufreinigung des Komplexes eine SDS-PAGE durchgeführt, an die sich eine tryptische Proteolyse und eine Messung per MALDI MS und MS/MS anschlossen. Mit dieser analytischen Strategie war es möglich, jede nicht-homologe Untereinheit nachzuweisen und 20 von 24 genombasierten Isoformen eindeutig zu identifizieren. Selbst kleine bzw. sehr hydrophobe Untereinheiten mit vielen Transmembranhelices konnten mit Hilfe dieser Methode analysiert werden. Die hohe Anzahl an präsenten, unterschiedlichen Isoformen und die vorherrschenden Verunreinigungen durch Fremdproteine (z.B. ATP-Synthase) könnten Indizien dafür sein, dass bis jetzt keine hinreichend stabile und reproduzierbare Enzympräparation gelungen ist, um eine Kristallstrukturanalyse durchzuführen. Im Allgemeinen kann der Ablauf eines solchen Proteomics-Experiments in drei Teile gegliedert werden: die Auftrennung eines Protein- oder Peptidgemischs zur Verringerung der Probenkomplexität, die Identifikation des Proteins per Massenspektrometrie und die damit verbundene bioinformatische Datenanalyse. Neben chromatographischen Methoden ist die Elektrophorese in Polyacrylamidgelen immer noch das am häufigsten angewandte Trennverfahren im Proteomics-Bereich. Vor der MS-Messung werden die aufgetrennten Proteine in der Regel direkt in der Gelmatrix verdaut. Die Qualität der Ergebnisse wird stark durch Proteinmenge und die auftretenden Probenverluste beeinflusst. Diese werden beispielsweise durch eine unzureichende Peptidextraktion aus dem Gel hervorgerufen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Gelsystem entwickelt, dass vor allem für die Proteolyseeffizienz, die Peptidextraktion und somit auch für die anschließende massenspektrometrische Messung von Vorteil ist. Das Monomer Acrylamid wird hierzu mit den beiden Quervernetzern N,N-Methylenbisacrylamid (MBA) und Ethylenglykoldiacrylat (EDA) polymerisiert. Es entsteht ein Gel, dessen Poren durch die basische Hydrolyse der Esterbindungen des EDAs vergrößert werden können, ohne die dreidimensionale Grundstruktur des Gels zu zerstören.   Die gemischten Gele mit MBA und EDA als Crosslinkern sind sowohl für Tris-Glycin- als auch Tris-Tricin-Puffersysteme einsetzbar. Die Evaluierung der Daten erfolgte meist gegen ein Standardgel mit T= 14% und C= 2,6%. Durch eine experimentell ermittelte Anpassung der Mischgele auf T+10% und C+45% mit einem MBA/EDA-Verhältnis von 0,5 verhalten sich die beiden Gelsysteme empirisch gleich und zeigen eine übereinstimmende elektrophoretische Trennung und Auflösung. Es gibt keine wesentlichen Nachteile in Bezug auf die Handhabung, die elektrophoretische Trennung und die anschließenden Analysen und Techniken, solange diese in sauren bis leicht basischen pH-Bereichen durchgeführt werden. So wurde das gemischte Gelsystem sowohl bei einer 2D IEF/SDS-PAGE als auch bei einem Western Blot-Experiment angewendet und für vollständig kompatibel befunden. Die gemessenen MS-Daten profitieren im Fall von Trypsin und Elastase erheblich von der besseren Zugänglichkeit des Enzyms zum Substratprotein und der verbesserten Peptidextraktion. Die Gelaufweitung führt zu signifikant besseren Ergebnissen, die größtenteils auf höhere S/N-Werte zurückzuführen sind. Die Signalintensitäten der Peptide sind um den Faktor 5 besser als die des Referenzgels. Der Nachweis von je 1 pmol der Proteine BSA, Serotransferrin und Alkoholdehydrogenase profitiert stark von den zusätzlich erhaltenen Daten, da die Zunahme an identifizierten Peptiden bei der PMF-Suche im Bereich von 40 bis 80% liegt. Auch bei geringen Proteinmengen wie 250 bzw. 50 fmol BSA ist die Anzahl der zugeordneten Signale um den Faktor 2-3 besser. Der in-Gel Verdau von 1 pmol Bacteriorhodopsin mit Elastase zeigt ebenfalls einen Anstieg der Peptidsignale um 60% im Vergleich zum Referenzgel. Da die Proteine im Gel alle mit kolloidalem Coomassie Brilliant Blue angefärbt wurden, kann davon ausgegangen werden, dass sich die guten MS-Ergebnisse auf jede mit diesem Farbstoff visualisierte Probe übertragen lassen. Für den Fluoreszenzfarbstoff RuPBS trifft dies ebenso zu, insgesamt wurden aber weniger Peptide als bei kolloidaler Coomassie Brilliant Blue-Färbung detektiert. Dementsprechend handelt es sich bei Acrylamidgelen mit MBA/EDA-Vernetzung um ein vielversprechendes alternatives Gelsystem, dass auf eine Vielzahl anderer Methoden angewendet werden kann.
• Being one component of the respiratory chain of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus, NADH:ubiquinone-oxidoreductase consists of 13 subunits encoded by 24 distinct genes. After purification of the whole complex, these subunits were subjected to SDS-PAGE separation and tryptic proteolysis for the final mass spectrometric confirmation by MALDI MS and MS/MS. Every non-homologous subunit and a total of 20 out of 24 genome-encoded isoforms could be unambiguously identified using this strategy. Even the detection of very small and/or hydrophobic subunits having multiple transmembrane helices was achieved. The multitude of existent unique isoforms and the present contaminations through accessory proteins (e.g. ATP synthase) might indicate that no adequately stable enzyme preparation currently exists to allow any determination of the crystal structure. Generally, the course of events in a proteomics experiment can be divided in three steps: the separation of a protein or peptide mixture to reduce the sample complexity, the identification by mass spectrometry and the concurrent bioinformatic data analysis. Besides chromatography, electrophoresis carried out in polyacrylamide gels still is the most frequently applied separation technique in proteomics. Prior to MS measurement the proteins are digested while embedded in the gel matrix. The quality of achievable results heavily depends on the protein amount and the sample losses which might occur e.g. due to inefficient peptide extraction from the gel. During this PhD thesis a new gel system was introduced which is beneficial for the proteolytic efficiency, peptide extraction and the subsequent mass spectrometric measurement. The monomer acrylamide is polymerized using the two crosslinkers N,N-methylene-bisacrylamide (MBA) und ethylene-glycol-diacrylate (EDA). The pores of the resultant gel can be expanded by alkaline hydrolysis of EDA’s ester bonds without sacrificing the three-dimensional structure of the gel. The hybrid gels containing MBA and EDA as crosslinker are compatible with Tris-glycine and Tris-tricine buffer systems. The assessment of gel performance was made in comparison to MBA standard gels with T=14% and C=2.6%. Through experimental adaption of T+10% and C+45% while keeping a MBA/EDA ratio of 0.5, both gels systems demonstrate a similar behavior concerning separation and resolution. No obvious disadvantages were found pertaining to handling, electrophoretic separation and downstream analysis, as long as the pH was maintained at acidic to low alkaline levels. The hybrid gel system was found fully compatible to 2D IEF/SDS-PAGE and immunoblot experiments. If either trypsin or elastase is employed, the obtained MS data substantially benefit from a better accessibility of the protease towards its substrate and the more efficient peptide extractions. The gel expansion yields significantly better results which can be primarily accounted to higher S/N values. Signal intensities are increased up to 5-fold compared to the reference gels. Analyses of 1 pmol BSA, serotransferrin and alcohol dehydrogenase heavily benefit from the additional data, because the increase of identified peptides during PMF search is in the range from 40 to 80%. Even when analyzing lower protein concentrations such as 250 or 50 fmol BSA, the number of assigned signals is enhanced 2 to 3-fold. A 60% increase in peptide signals is also observed in an in-gel digest of 1 pmol bacteriorhodopsin with elastase. As all proteins were stained using colloidal Coomassie Brilliant Blue it is assumed that improved MS results are possible with every equally stained protein sample. This is also the case for the fluorescent dye RuBPS, albeit peptide numbers were generally lower than in colloidal Coomassie Brilliant Blue stained samples. Consequently, acrylamide gels containing MBA/EDA crosslinks are a promising alternate gel system which is compatible to a variety of other methods and techniques.