Establishment of an Escherichia coli cell-free expression system for the large scale production of selected membrane proteins

Membrane proteins play vital role in a variety of cellular processes, such as signal transduction, transport and recognition. In turn they are involved in numerous human diseases and currently represent one of the most p
Membrane proteins play vital role in a variety of cellular processes, such as signal transduction, transport and recognition. In turn they are involved in numerous human diseases and currently represent one of the most prevalent drug targets. A comprehensive understanding of the mechanisms mediated by membrane proteins requires information about their structures at near-atomic resolution, although structural studies of membrane proteins remain behind those of soluble proteins. A bottleneck in the study of membrane proteins resides in the difficulties that are encountered during their high-level production in cell based systems. However, many toxic effects attributed to the over production of membrane proteins are eliminated by cell-free expression, as viable host cells are no longer required. Therefore, the objective of this study was to obtain adequate amounts of selected membrane transport proteins for their structural studies using a cell-free expression system. For the establishment of the cell-free system for membrane proteins, the transporters YbgR and YiiP from Salmonella typhimurium LT2, PF0558 and PF1373 from Pyrococcus furiosus, from the cation diffusion family (CDF), BetP from Corynebacterium glutamicum from the betaine/carnitine/choline transporter (BCCT) family and Aq-2030 from Aquifex aeolicus VF5 from the monovalent cation/proton antiporter-2 (CPA2) family were selected. An Escherichia coli S-30 extract based cellfree system was established by generating the best expression constructs of the target proteins, preparing T7 RNA polymerase and an S-30 extract with high translation efficiency. The functionality of the S-30 extract was shown by the cell-free expression of correctly folded Green Fluorescent Protein (GFP). Essential factors of the cell-free system such as the Mg2+ concentration, the bacterial S-30 extract proportion in the reaction mixture and the time-course of cell-free reactions have been optimized. For the cell-free production of membrane proteins in soluble form, the possibility to supplement cell-free reactions with detergents was explored. A wide range of non-ionic or zwitterionic detergents, were found to be compatible with cell-free synthesis, while ionic detergents and non-ionic detergents at high concentrations had an inhibitory effect. Moreover, high concentrations of polyoxyethylene-alkyl-ethers (Brij) detergents were found to have enhancing effect on the production levels as well as on the solubility of cell-free produced proteins. As membrane proteins tend to misfold and aggregate in a membrane-free translation system, the possibility to supplement the cell-free reactions with inner membrane vesicles (IMVs) to obtain correctly folded target transport proteins was explored. All the target proteins were successfully produced in the batch cell-free reactions and were found to be incorporated in the IMVs. A continuous exchange cell-free (CECF) system was established, where consumable substrates (amino acids, nucleotides and energy regenerating compounds) were supplied to the cell-free reaction mixture through a dialysis membrane, which in consequence resulted in high-level production of target proteins compared to the batch system. The osmosensing and osmoregulated sodium-coupled symporter BetP from C. glutamicum was chosen for the large scale production in CECF set-up. The protein is easily produced in E. coli and is functional as assayed by its transport activity, after purification and reconstitution in liposomes. It is therefore possible to compare in-vivo and cell-free production. High-level cell-free production of BetP was achieved in CECF mode in different forms: (i) as precipitate, (ii) as soluble form in detergent, and (iii) incorporated in IMVs. Cell-free production of BetP resulted in the yield of about 0.5 mg of purified BetP from 1 ml of CECF reaction. The yield of purified BetP was increased to 1.6 fold by addition of 1% polyoxyethylene-(20)-cetyl-ether (Brij58) detergent in the reaction mixture. Moreover, the high level cell-free production of BetP (0.5 mg purified BetP/ml reaction mixture) incorporated in IMVs was shown for the first time in this work.However, it was observed that oligomerization of BetP was not efficient in the cell-free system. Factors that can promote the folding of membrane proteins such as lipids and chaperones were investigated. Addition of lipids and molecular chaperone GroE facilitated correct folding of BetP resulting in increased yield and stability of cell-free produced BetP. The results obtained indicate that most of the cell-free produced BetP exists in functional oligomeric form. The possibility of obtaining milligram amounts of BetP, a 12 trans-membrane protein from the cell-free reactions holds promise for structural and functional studies of other membrane proteins. In any case, the strategies adapted in this study should prove extremely valuable for the production of membrane proteins in the E. coli cell-free expression system.
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Membranproteine sind in fast allen wichtigen zellulären Prozessen von essentieller Bedeutung. Wichtige Funktionen von Membranproteinen sind insbesondere die Signalübertragung zwischen Zellen, der Transport von Stoffen du
Membranproteine sind in fast allen wichtigen zellulären Prozessen von essentieller Bedeutung. Wichtige Funktionen von Membranproteinen sind insbesondere die Signalübertragung zwischen Zellen, der Transport von Stoffen durch die Zellmembran und die Energieumwandlung. Membranproteine repräsentieren ungefähr 25% aller kodierten Proteine eines Genomes. Trotz ihrer Bedeutung bleiben Membranproteine in strukturellen Studien ein unterrepräsentiertes Gebiet. Die zellfreie (CF = Cell free) Proteinsynthese ergänzt die bisherigen Methoden. Im Gegensatz zu der in vivo Expression, bei der die Proteinbiosynthese in der Zelle durchgeführt wird, stellt die CF Proteinsynthese ein vollständig offenes System dar. Das CF-System ist daher flexibel, kontrollierbar und erlaubt direkte Steuerung der Reaktion. Es ermöglicht die Synthese von regulativen und toxischen Proteinen, den Einbau artifizieller oder modifizierter Aminosäuren für NMR Untersuchungen oder Selenomethionin für die Röntgenkristallographie. Die CF-Sythese von wasserlöslichen Proteinen ist ausführlich in der Literatur beschrieben, während für Membranproteine nur wenige Studien verfügbar sind, die sich auf die Untersuchung der Proteintranslokation beschränken. Ziel dieser Arbeit war es, ein CF-System für die Produktion ausgewählter Membraneproteine zu entwickeln. Der Transport von Substraten wie Ionen, Zucker, Aminosäuren oder Nukleinsäuren wird durch Membranproteine vermittelt. Dabei ist der Transport des Substrates an die ATP Hydrolyse oder an den Transport von Protonen oder Natrium gekoppelt. Der Abtransport von Giftstoffen und die Aufnahme von Substraten gegen einen Konzentrationsgradienten wird durch ionengekoppelten Transport vermittelt, weshalb Transporter eine medizinische Relevanz haben. Daher wurden in dieser Arbeit Membrantransportproteine für die Optimierung eines CF-Systems ausgewählt. Als Zielproteine wurden Vertreter aus verschiedenen Transportfamilien ausgewählt: YiiP und YbgR aus Salmonella typhimurium LT2, PF0558 und PF1373 aus Pyrococcus furiosus aus der CDF-Familie (Cation Diffusion Facilitator), BetP aus Corynebacterium glutamicum aus der BCCT Familie (betaine/carnitine/choline transporter) und Aq_2030 aus Aquifex aeolicus VF5 aus der CPA2-Familie (cation/proton antiporter2). Die codierenden DNA-Sequenzen der Zielproteine wurden in die drei Vektoren pET28a+, pGEM3 und pIVEX2.3d kloniert, die unter der Kontrolle des T7-Promotors stehen. Die Expression der Sequenzen in diesen Vektoren wird durch Expression im Escherichia coli Stamm BL21 und im CF-System getestet. pIVEX2.3d Plasmide lieferten die höchste Expression in vivo und im CF-System. Es konnte festgestellt werden, dass die regulierenden Komponenten des pIVEX2.3d Vektors besser für die Produktion der ausgewählten Membranproteine verwendbar sind als die Vektoren pET28a+ und pGEM3. Mehrere Schritte waren notwendig, um die Zusammensetzung des CFReaktionsgemisches zu optimieren und damit die höchste Ausbeute zu erreichen. Die T7-RNA Polymerase ist ein sehr wichtiger Bestandteil der CF Expression, da sie die genetische Information der DNA in mRNA überträgt. Die heterologe Expression der T7-RNA Polymerase in BL21 E.coli Bakterien, sowie deren Aufreinigung in reiner und aktiver Form, ermöglichte nicht nur eine Verringerung der Kosten sondern half auch bei der Entwicklung eines individuellen CF-Systems. Von zentraler Bedeutung ist das Mg2+, das eine wesentliche Rolle bei der Stabilisierung der RNA Konformation und bei der Interaktion der ribosomalen Untereinheiten im 70S Komplex spielt. Für die CFProduktion ist es erforderlich, die Mg2+ Konzentration zu optimieren. Die Mg2+ Konzentration wurde in den CF-Reaktionen variiert und die maximale Syntheseausbeute der Testproteine BetP und YiiP wurde bei 15.5 mM Mg2+ erreicht. Ein weiterer wichtiger Bestandteil ist der S-30 Extrakt, der alle wesentlichen Bestandteile für die Proteintranslation enthält. Bei der Optimierung des S-30 Extrakt-Anteils im CF-Reaktionsgemisch wurde die höchste Produktion beider Proteine bei einem Anteil von 55% erhalten. Eine besondere Herausforderung stellt die CF-Synthese von funktionellen Membranproteinen dar, deren komplexer Faltungsprozess von der hydrophoben Umgebung abhängt. Die Produktion eines Membranproteins in der CF-Synthese ergibt Protein in nicht löslichen Präzipitaten. Der Zusatz von Detergens während der CF-Synthese ermöglicht die korrekte Faltung und Solubilisierung der Membranproteine in Detergens-Micellen. Das Detergens kann jedoch die Transkription und Translation im CF-System stören. Abhängig von der Toleranz durch das CF-System für das jeweilige Detergens konnten hohe Detergenskonzentrationen hinzugefügt werden, die die vollständige Löslichkeit der Membranproteine in homogener Form ermöglichte. Die Toleranz des CF-System in Abhängigkeit verschiedener Detergenzien bei zweifacher CMC auf die Produktion von BetP und YiiP wurde untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Detergenzien wie Octyl-ß-D-Glucosid (OG), Desoxycholat, CHAPS, und Fos-Cholin die CF-Proteinbiosynthese sogar bei niedriger Konzentration hemmen. Im Gegensatz dazu haben Tween20, Dodecyl-ß-D Maltosid (DDM) und Triton X-100 bei niedrigen Konzentrationen keinen hemmenden Effekt auf die CF-Produktion von Membranproteinen. Unter allen geprüften Detergenzien waren die langkettigen Polyoxyethylenalkylether (Brij) wie Brij35 und Brij58 am besten geeignet, da sie die CFProduktion von BetP und von YiiP auch bei sehr hoher Konzentration (60 fache CMC) nicht hemmten. Zugabe der Brij Derivate Brij58, Brij76 und Brij78 (60-180 fache CMC) erhöhte die Ausbeute von BetP, wobei sich 80% des produzierten Proteins in der löslichen Fraktion befanden. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass Brij-Derivate die erste Wahl für die Produktion von Membranproteinen in löslicher Form im CF-System sein sollten. Invertierte Membranvesikel (IMVs), die die Translokationsproteine (SecY-SecA Translokon) zur Unterstüzung der korrekten Faltung der Membranproteine enthalten, werden häufig in analytischen CF-Systemen benutzt, um die Insertion von Membranproteinen zu untersuchen. Deshalb wurde das CF-System mit IMVs ergänzt, die mit Natriumkarbonatlösung mit hohem pH zur Entfernung peripherer und schwach gebundener Proteine behandelt waren. Alle Zielproteine, der Antiporter Aq_2030, die Transportproteine PF0558, PF1373, YbgR und YiiP und der Symporter BetP, konnten nicht nur erfolgreich produziert werden, sondern waren auch in die Membran insertiert. Bei der CF- Produktion im Batchverfahren wurde beobachtet, dass die Synthese von BetP nach 30 Minuten und von YiiP nach 1 Stunde stoppt, vermutlich durch den kompletten Verbrauch der Energiequelle Phosphoenolpyruvat und der essentiellen Aminosäuren im Reaktionsgemisch. Durch die Benutzung eines kontinuierliches CFAustauschverfahren (continuous exchange cell-free, CECF-System) kann die Reaktionszeit deutlich verlängert werden. Das Reaktionsgemisch ist von einem Substratreservoir, das Aminosäuren, Nukleinsäuren und die Energiequelle enthält, durch eine Dialysemembran getrennt, so dass ein Austausch niedermolekularer Bestandteile möglich ist. Alle Zielproteine wurden erfolgreich im CECF-System produziert. BetP, ein osmoregulierender Transporter aus C. glutamicum, das Glycinbetain im Symport mit Natrium Ionen transportiert, ist das am besten untersuchte Protein aus der Liste der ausgewählten Membranproteine. BetP wurde deshalb als Modelprotein für die weitere Optimierung des CF-system im CECF-Modus zur Herstellung ausreichender Mengen für die funktionelle und strukturelle Charakterisierung benutzt. Drei verschiedene Ansätze zur Produktion von BetP im CECF-System wurden untersucht, nämlich die Produktion in Präzipitaten, in löslicher Form mit Zugabe des Detergens Brij58 und in IMVs. CECF-Reaktionen wurden ohne die Ergänzung von Detergens und Lipide optimiert, um eine hohe Ausbeute von BetP als Präzipitat zu erzielen. Die optimale Bedingung für die Produktion von BetP mittels der CECF-Reaktionen war Inkubation über Nacht bei 30°C. Die Solubilisierung eines Membranproteins, das im CECF-System produziert wird, unterscheidet sich deutlich von der herkömmlichen Solubilisierung aus der biologischen Membran. Der offensichtlichste Unterschied ist das Fehlen einer Membran, die das Zellfrei-produzierte Protein umgibt. Eine Vielzahl von Detergenzien für Solubilisierung von CF-produziertem unlöslichen BetP wurde geprüft. Fast alle Detergenzien ausgenommen Desoxycholate und CHAPS, waren in der Lage, BetP zu solubilisieren. 1-lauryl-2-hydroxy-glycero-3-phosphoglycerin (LMPG), Fos16 und Zwittergent waren am besten für die Solubilisierung geeignet. Während der Solubilisierung und Reinigung in DDM zeigte CF-produziertes BetP eine größere Tendenz zu aggregieren als in Gegenwart von Fos16. In vivo produziertes BetP ist in DDM und in Fos16 stabil. Zusätzlich war die Ausbeute von CF-produziertem BetP, das in Fos16 aufgereinigt wurde (400-500 µg/ml Reaktionsansatz) höher als in DDM gereinigtem (300 µg/ml Reaktionsansatz). Der oligomere Zustand eines Proteins ist ein wichtige Parameter in strukturellen und funktionellen Studien. BetP liegt in DDM solubilisiert als Trimer vor was durch analytische Ultrazentrifugierung gezeigt wurde (Ziegler et al. 2004). In Fos16 solubilisiertes BetP zeigte ein ähnliches Retentions volumen, was den Schluß zuläßt, dass es ebenfalls als Trimer vorliegt. Wie oben gezeigt, konnten bedeutende Mengen BetP (500 µg/ml Reaktionsansatz) in CECF-Reaktionen produziert und aufgereinigt werden. Im nächsten Schritt wurde der oligomere Zustand von CF- und in vivo produziertem Protein mittels Gelfiltration überprüft und verglichen. In vivo produzierte BetP-Trimere eluierten als einzelner Peak , während CF produziertes BetP in zwei Peaks eluierte. Einer der Peaks entspicht der Größe des Trimers der in vivo Probe, während der andere Peak ein niedrigeres Molekulargewicht hat. Anhand der Kalibrierung der Gelfiltrationssäule mit löslichen Proteinen wurde vermutet, dass es sich hierbei um BetP Dimere handelt. Hiermit konnte gezeigt werden, dass keine vollständige Bildung von Trimeren von im CF-System produziertem BetP auftrat. Es ist bekannt, dass spezifische Lipide häufig an Membranproteine binden und wichtig für die Faltung und Stabilität sein können. Deshalb wurde die Aufreinigung von CF produziertem BetP in Anwesenheit von Lipiden durchgeführt. Die Ergänzung mit Lipiden, vor allem Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylglycerin (PG), erhöhte nicht nur die Ausbeute sondern auch den Anteil von Trimeren. Da die Zugabe von Brij58 bis zur 120 fachen CMC einen positiven Effekt auf die CF-Produktion von BetP in löslicher Form hatte, wurde die CECF-Reaktion mit Brij58 ergänzt. Dies erhöhte die Ausbeute von BetP in CECF-Reaktionen um das 1,6 fache. Die Aufreinigung von BetP mittels in vivo Expression, die arbeits- und zeitaufwendig ist, ergab ca. 800 µg Protein aus 1 L E.coli Zellkultur. Ähnliche Mengen von gereinigtem BetP (800µg) wurden aus nur 1 ml mit Brij58 ergänzter CECF-Reaktion erhalten. In dieser Studie wurden mehrere Membranproteine erfolgreich in IMVs produziert. CECF-Reaktionen von BetP wurden in großem Maßstab in Anwesenheit von IMVs durchgeführt. Es wurde erwartet, dass Solubilisierung und Reinigung von BetP aus IMVs und Reinigung von BetP aus E.coli Membranen ähnlich sind. DDM, Brij35, Brij58, OG, CHAPS, Triton X-100 und Tween20 eigneten sich nicht für die Solubilisierung von BetP aus IMVs. Fos16 dagegen solubilisiert BetP fast vollständig aus IMVs. Ein Vergleich der Reinigung von BetP aus IMVs mit DDM und Fos16 ergab, dass BetP mit DDM gereinigt hauptsächlich in aggregierter Form vorlag, während es in Fos16 stabil war. Aus 1ml Reationsansatz mit zugesetzen IMVs konnten 250 µg BetP aufgereinigt werden. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, ist Fos16 das wirksamste Detergens für die Solubilisierung und Reinigung von CF-produziertem BetP. Das Verhalten des in den CFReaktionen in IMVs und dem als Präzipitat produziertem BetP gegenüber verschiedenen Detergenzien sowie während der Aufreinigung ist einander sehr ähnlich, wobei es sich von in vivo produziertem BetP erheblich unterscheide. Die Verwendung von IMVs im CF-Reaktionsgemisch, ist ein geeigneter Ansatz für die funktionelle CF-Synthese von Membranproteinen. Obwohl zahlreiche Proteine erfolgreich im CF-System ohne Zugabe von Chaperonen hergestellt wurden, konnte gezeigt werden, dass die Zugabe positiven Einfluss auf Menge und Aktivität der produzierten Proteine hatte. Deshalb wurde der Einfluss des Chaperons GroE (GroEL und GroES) auf die CF-Synthese von BetP untersucht. In unserem CECF-System ergab die Zugabe von GroE in den Reaktionen ohne Brij58/IMVs eine leicht verbesserten Ausbeute. Die Analyse mittels Gelfiltration ergab zudem, dass definierte Oligomere von BetP gebildet wurden, nämlich Aggregate, Trimer und ein kleineres Oligomer. Die Zugabe von GroE zu den CECF-Reaktionen mit 1 % Brij58 ergab keine verbesserte Ausbeute, aber der Anteil von korrekt gefaltetem BetP konnte erhöht werden. Als GroE den Reaktionsanstaz mit zugesetzten IMVs hinzugefügt wurde, konnte kein bedeutender Unterschied bezüglich der Oligomerisierung von BetP beobachtet werden, aber die Ausbeute von BetP wurde auf 500 µg/ml Reaktionsansatz verdoppelt. Da bedeutende Mengen von korrekt gefaltetem BetP mittels CECF Reaktion hergestellt werden konnten, sollte im nächsten Schritt die Transportaktivität von BetP überprüft werden. Um diese zu untersuchen muss BetP in Liposomen rekonstituiert werden. CF- und in vivo produziertes BetP konnten rekonstituiert werden, wie durch Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie gezeigt wurde. Die Reinigung des Zellfreiproduzierten BetP erfordert Fos-Cholin, während bisher für funktionelles Protein aus dem E. coli Expressionssystem das Detergens DDM verwendet wurde (Rubenhagen et al. 2000). Daher wurde die Funktionalität von in vivo produziertem BetP nach Fos-Cholin Reinigung und anschließender Rekonstitution getestet. Transportaktivität und Osmoregulation zeigen, dass das Protein vollständig funktionsfähig ist. CF produziertes BetP zeigte eine geringere Rekonstitutionsrate als in vivo produziertes BetP. Trotzdem sollte es möglich sein die Aktivität von CF produziertem BetP in Liposomen zu bestimmen. In der vorliegenden Arbeit konnte ein zellfreies Produktionssystem für die Herstellung von Membranproteinen etabliert werden. Verschiedene Transportproteine aus P. furiosus, S. typhimurium LT2, A. aeolicus VF5 und C. glutamicum, mit 4-12 Transmembransegmenten und einer Länge zwischen 295-595 Aminosäuren konnten erfolgreich produziert werden. Weiterhin war die zellfreie Herstellung von BetP im CECF-Modus in drei verschiedenen Formen möglich, (i) als Präzipitat mit anschließender Detergenssolubilisierung (ii) in der löslichen Form in Gegenwart von Brij58 und (iii) inkorporiert in IMVs. Es konnte gezeigt worden, dass die Ergänzung mit Lipiden während der Reinigung und des Chaperones GroE während der Synthese die Ausbeute von gereinigtem BetP im CECF-System erhöht und Aggregation verhindert. Die Ausbeute ist geeignet, um funktionelle und strukturelle Studien zu beginnen.
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Metadaten
Author:Shweta Tiwari
URN:urn:nbn:de:hebis:30-46507
Referee:Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2007/07/13
Year of first Publication:2007
Publishing Institution:Univ.-Bibliothek Frankfurt am Main
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Univ.
Release Date:2007/07/13
Pagenumber:IX, 152
Note:
Diese Dissertation steht leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext im WWW zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden. 
HeBIS PPN:32256090X
Institutes:Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:570 Biowissenschaften; Biologie
660 Chemische Verfahrenstechnik
Sammlungen:Universitätspublikationen
Weitere biologische Literatur (eingeschränkter Zugriff)
Licence (German):License LogoArchivex. zur Lesesaalplatznutzung § 52b UrhG

$Rev: 11761 $