Open Access

Frank Becker

• Diseases such as cardiac arrhythmias, CPVT and other issues of the human heart still remain largely unexplored. To contribute to this field of research, it is necessary to create tools to control the spatial and temporal release and reuptake of Ca2+ from the sarcoplasmic/endoplasmic reticulum (SR/ER). Ca2+ release and uptake by the ryanodine receptor (RyR) and Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA), respectively, are essential for the function of excitable cells. In this process, the rapid Ca2+ release from the SR/ER and the associated contraction in muscle cells is modulated by RyR. However, diseases due to calcium leakage, such as cardiac arrhythmias, seizures and contractile dysfunction, are also caused by RyR. The resting Ca2+ concentration in the cytosol, which is important for the cell, is kept in balance by Ca2+ release and reuptake into the SR/ER. This reuptake is controlled quite considerably by SERCA. SERCA is important for development and muscle function in both nematodes such as C. elegans and mammals, though there is also a great need for tools that can help study precise function. To advance towards the goal of developing tools for optogenetic stimulation of intracellular Ca2+ release from the SR/ER, the model organism C. elegans was chosen. Its advantages are the fully sequenced genome and the neural network connectome. In addition, the ease of maintenance, self-fertilisation, transparency and rapid generation cycles, as well as the fact that it is a eutelic animal, are advantages for the application of the optogenetic approach. So far, tools for light-induced Ca2+ release (LICR) have already been developed, involving the creation of ChR2 versions with higher Ca2+ conductivity based on the "CatCh" variant and further improving their conductivity through several established mutations. In addition, the pharynx of C. elegans was modified to produce an optogenetically stimulated muscle pump that resembles mammalian cardiac muscle cells. In this work, both optoUNC-68 (optically excitable RyR) and SERCA/LOV2 were generated in different variants by CRISPR/Cas9 and plasmid-based genome editing to achieve light-driven manipulation of calcium homeostasis in C. elegans. Here, LICR was triggered by LOV2 domains in an opto-mechanical manipulation of RyR as well as SERCA. This approach was made possible by recently published high-resolution cryoEM structural images. In addition, alternative approaches using Ca2+ conductance-optimised channelrhodopsin variants were tested in C. elegans body wall muscle cells. By inserting ChR-XXM into C. elegans and subsequent fluorescence microscopy of the co-introduced GFP, an expression in body wall muscle cells could be detected. Furthermore, in contraction assays, ChR-XXM was demonstrated to induce contractions of the animals of up to 16% compared to the original body length in both medium (0.8mW/mm²) and high (1.4mW/mm²) stimulation at 470nm. ChR-XXM was thus identified as an excellent candidate for the development of an optogenetic tool, as it exhibits significantly increased Ca2+ conductivity compared to other ChR2 variants. The use of CRISPR/Cas9 to insert AsLOV2 domains (L404-L546) into different insertion sites of RyR allowed the generation of a transgenic strain of C. elegans that could be stimulated to elongate during 0.3mW/mm² photostimulation. This demonstrated that RyR can be manipulated by photostimulation, spatiotemporally through conformational changes in the LOV2 domain and the resulting disruption of the pore region. The CRISPR/Cas9 method was also used to insert LOV2 domains into SERCA. Here it could be demonstrated that a conformational change of the LOV2 domains induced by photostimulation leads to a stop or impairment of Ca2+ ion translocation by SERCA from the cytosol into the SR/ER. In contrast to LOV2 in RyR, this resulted in a contraction of C. elegans body length. The data presented here indicate that the intracellular Ca2+ cycle involving the SR/ER and cytosol can be successfully manipulated by the introduction of optogenetic tools. It turned out that the manipulation/impairment of individual components of this system, such as RyR or SERCA, is usually insufficient to achieve a clear response. Therefore, simultaneous manipulation of the two main actors RyR and SERCA is arguably the best way to take another step towards creating optogenetic tools for light-stimulated manipulation of Ca2+ release and reuptake from the SR/ER.
• Krankheiten wie Herzrhythmusstörungen, CPVT und andere Probleme des menschlichen Herzens sind in großen Teilen immer noch unerforscht. Um auf diesem Gebiet der Forschung einen Beitrag zu leisten, ist es notwendig, dass Werkzeuge zur Kontrolle der räumlichen und zeitlichen Freisetzung und Wiederaufnahme von Ca2+ aus dem sarkoplasmatischen/endoplasmatischen Retikulum (SR/ER) entwickelt werden. Die Freisetzung und Aufnahme von Ca2+ durch den Ryanodin-Rezeptor (RyR) bzw. die Ca2+-ATPase des sarko-endoplasmatischen Retikulums (SERCA) sind für die Funktion erregbarer Zellen von wesentlicher Bedeutung. Dabei wird die schnelle Ca2+-Freisetzung aus dem SR/ER und die damit verbundene Kontraktion in Muskelzellen in großen Teilen durch RyR moduliert. Jedoch werden auch Krankheiten, die auf einem Kalziumleck beruhen, wie z. B. Herzrhythmusstörungen, Krampfanfälle und kontraktile Dysfunktion, durch RyR verursacht. Die für die Zelle wichtige Ruhe-Ca2+-Konzentration im Zytosol wird durch Ca2+-Freisetzung und Wiederaufnahme in das SR/ER im Gleichgewicht gehalten. Diese Wiederaufnahme wird in erheblichem Maße von SERCA kontrolliert. Der Ryanodin-Rezeptor und SERCA bilden die beiden Hauptakteure des Ca2+ Zyklus an der sarko-endoplasmatischen Membran und sind daher ideale Kandidaten für die Erforschung der Ca2+ Freisetzung und Wiederaufnahme in das SR/ER. SERCA ist sowohl bei Nematoden wie C. elegans als auch bei Säugetieren für die Entwicklung und die Muskelfunktion wichtig. Dies spiegelt sich vor allem in der Tatsache, dass Mutationen, die zu einem Funktionsverlust führen, zur Letalität führen. Daher gibt es auch hier großen Bedarf an Werkzeugen, die zur Erforschung der genauen Funktion von SERCA beitragen können. Um dem Ziel der Entwicklung von Werkzeugen zur optogenetischen Stimulation der intrazellulären Ca2+-Freisetzung aus dem SR/ER näher zu kommen, wurde der Modellorganismus C. elegans gewählt. Seine Vorteile sind unter anderem das vollständig sequenzierte Genom und das Konnektom des neuronalen Netzes. Darüber hinaus sind die einfache Pflege, die Selbstbefruchtung, die Transparenz und die schnellen Generationszyklen sowie die Tatsache, dass es sich um ein eutelisches Tier handelt, von Vorteil bei der Durchführung optogenetischer Verfahren. Bisher wurden bereits Instrumente für die lichtinduzierte Ca2+-Freisetzung (LICR) entwickelt. Dabei wurden ChR2-Versionen mit höherer Ca2+-Leitfähigkeit, basierend auf der "CatCh"-Variante erstellt, und die weitere Verbesserung ihrer Leitfähigkeit durch mehrere etablierte Mutationen durchgeführt. Darüber hinaus wurde der Pharynx von C. elegans genetisch so angepasst, dass er eine optogenetisch stimulierte muskuläre pumpe simuliert, die den Herzmuskelzellen von Säugetieren ähnelt. In dieser Arbeit wurde auf Grundlage früherer Veröffentlichungen in einem ersten Schritt versucht, eine verkürzte Version des humanen Ryanodin-Rezeptors zu erstellen. Diese verkürzte Version sollte den mit 2 MDa sehr großen Rezeptor auf ein notwendiges Minimum reduzieren, das hauptsächlich aus dem Transmembranteil von hRyR bestand. Hierfür wurde der größte Teil des zytoplasmatischen "Kopfes" abgeschnitten. Dieses verkürzte hRyR sollte einfacher zu handhaben sein und besser mit anderen optogenetischen Werkzeugen kombiniert werden können. Einfaches „kürzen“ des Ryanodin Rezeptors aber auch eine modifizierte verkürzte Version, in der der die lange Zentrale Domäne erhalten wurde, konnten jedoch nicht erfolgreich exprimiert werden. Zur gleichen Zeit wurde in parallel dazu geführten Klonierungen dem verkürzten hRyR mit langer Zentraler Domäne C-Terminal ein modifiziertes Channelrhodopsin mit Fluorophor und linker (CatChUP::eYFP::linker Crp1) angehängt. In das verkürzte hRyR mit langer Zentraler Domäne wurden unter anderem auch LOV2 Domänen an verschiedenen insertionsstellen eingefügt. Die Insertion dieser LOV2 Domänen fand meist zwischen α-Helices und β-Faltblättern statt um dort eine möglichst effiziente Konformationsänderung hervorzurufen. Hierbei musste darauf geachtet werden, dass die Insertion der LOV2-Domäne und die Konformationsänderung bei Stimulation, nicht zu einer zu starken Veränderung der Tertiärstruktur und damit einer Einschränkung der Funktionalität führte. Die Insertion des verkürzten RyRs inklusive des CatChUP Konstrukts führte dazu das durch Injektion keine transgenen Nachkommen von C. elegans erzeugt wurden. Wildtyp und lite-1 Tiere brachten jedoch nach Injektion von verkürztem hRyR inklusive integriertem LOV2 lebensfähige Nachkommen hervor. Es zeigte sich sowohl für Wildtyp als auch lite-1 transgene Tiere, dass auch hier das verkürzte hRyR und LOV2 nicht ausreichte um eine eindeutige signifikante Änderung des Schwimmverhaltens oder eine Kontraktion der Körperlänge auszulösen...