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Wiebke Duckwitz

• P2X-Rezeptoren sind ligandengesteuerte Kationenkanäle, die durch extrazelluläres ATP aktiviert werden. Bisher wurden sieben Isoformen kloniert (P2X1-P2X7), die eine gemeinsame Topologie besitzen, bestehend aus intrazellulären N- und C-Termini, zwei Transmembranregionen und einer großen Ektodomäne. Um funktionelle Ionenkanäle ausbilden zu können, müssen P2X-Untereinheiten in Homo- oder Heterotrimere assemblieren. Das übergeordnete Ziel der vorliegenden Arbeit war das Identifizieren von Proteindomänen, die zu der Trimerisierung von P2X-Untereinheiten beitragen. Hierzu diente in erster Linie die humane P2X5- (hP2X5-) Untereinheit, der durch Herausspleißen von Exon 10 eine Region fehlt, die in der Literatur als eventuell wichtig für die Assemblierung beschrieben wird. Exon 10 kodiert 22 Aminosäuren, die in der distalen Ektodomäne und der äußeren Hälfte der zweiten Transmembranregion liegen. Das Fehlen dieser Aminosäuren führt zu Untereinheiten, die nicht in der Lage sind, zu trimerisieren und funktionelle Ionenkanäle auszubilden. Durch das schrittweise Einsetzen der von Exon 10 kodierten Aminosäuren in die hP2X5-Untereinheit sowie die Expression verschiedener Alanin-Mutanten mit nachfolgender Analyse durch Blaue-Native-PAGE konnte gezeigt werden, dass das fehlerhafte Assemblierungsverhalten der hP2X5-Untereinheit in erster Linie durch das Fehlen der äußeren Hälfte der zweiten Transmembranregion bewirkt wird. Zusätzliche gezielte Mutationen und die Konstruktion von Deletionsmutanten ergaben weiterhin, dass die zweite Transmembranregion vornehmlich als hydrophober Membrananker dient, um die korrekte Topologie und Positionierung von Assemblierungsdomänen zu gewährleisten. Die wichtigsten Assemblierungs-informationen scheinen in der Ektodomäne zu liegen. Die einzige Aminosäure in der zweiten Transmembranregion, die einen spezifischen Einfluss auf die Trimerisierung von hP2X5-Untereinheiten hatte, war 355D. Einzelmutationen in dieser Position zeigten, dass nur Aminosäuren, deren Seitenketten in der Membran interhelikale Wasserstoffbrücken ausbilden können, eine effiziente Trimerisierung ermöglichen. Dieses Ergebnis legte den Schluss nahe, dass 355D die Assemblierung unterstützt, indem es die Interaktion zwischen den Untereinheiten über eine Wasserstoffbrückenbildung stabilisiert. Die Suche nach einem potentiellen Interaktionspartner von 355D in der ersten Transmembranregion durch Einzelmutationen und Cystein-Crosslinking war allerdings nicht erfolgreich. Dies könnte bedeuten, dass die beiden Transmembranregionen jeweils benachbarter Untereinheiten nicht, wie für P2X2-Untereinheiten gezeigt, in einer „head to tail“-Orientierung angeordnet sind, sondern nur die zweiten Transmembranregionen miteinander in Kontakt stehen. Limitierte Proteolyse von hP2X5-Rezeptormutanten ergab einen engen Zusammenhang zwischen der Trimerisierung und der Resistenz gegenüber einer Proteolyse durch Trypsin. Daraus folgt, dass trimerisierungsfähige P2X-Mutanten korrekt gefaltet sind, während ein Verlust der Trimerisierungsfähigkeit eine Fehlfaltung anzeigt. Neben dem hP2X5-Rezeptor wurden auch Ratten-P2X1- (rP2X1-) Rezeptoren untersucht. rP2X1-Konstrukte, die lediglich aus der Ektodomäne sowie einem abspaltbaren Signalpeptid bestanden, konnten zwar partiell multimerisieren, aber keine definierten Trimere bilden. Die Analyse weiterer Konstrukte zeigte, dass beide Transmembranregionen für die Trimerisierung wichtig sind, auch wenn sie keine spezifischen Assemblierungsinformationen enthalten. Ein systematisches Alanin-Scanning der gesamten Ektodomäne der rP2X1-Untereinheit ergab, dass die Ektodomäne multiple Sequenzmotive enthält, die zu der Trimerisierung beitragen. Die genaue Rolle der identifizierten Sequenzmotive muss in weiteren Experimenten geklärt werden. Zusätzlich wurden Chimären aus rP2X1- und Ratten-P2X6- (rP2X6-) Untereinheiten untersucht. Da rP2X6-Untereinheiten nicht in der Lage sind zu trimerisieren, könnten sie in Kombination mit Sequenzelementen aus rP2X1-Untereinheiten ermöglichen, trimerisierungsrelevante Proteindomänen zu identifizieren. Es zeigte sich, dass eine Chimäre, die die Ektodomäne der rP2X1-Untereinheit und die Transmembranregionen und zytosolischen Domänen der rP2X6-Untereinheit enthielt, trimerisieren konnte, während die umgekehrte Chimäre dies nicht vermochte. Dies war ein weiterer Hinweis darauf, dass die Motive, die für die Trimerisierung von P2X-Untereinheiten essentiell sind, in der Ektodomäne liegen. Zusammenfassend belegen diese Ergebnisse, dass die Transmembranregionen bei der Assemblierung im Wesentlichen eine Funktion als hydrophobe Membrananker haben, die die korrekte Topologie und Positionierung der extrazellulären Assemblierungsdomänen ermöglichen. Die initiale Assemblierung wird durch die Ausbildung einer interhelikalen Wasserstoffbrücke über 355D stabilisiert. Somit können die wichtigsten Assemblierungsdomänen in Kontakt treten, die in der Ektodomäne lokalisiert sind.
• P2X receptors are ligand gated Ion channels which are activated by extracellular ATP. Seven subunits have been cloned, designated P2X1-P2X7, which share a common topology with cytosolic N and C terminal domains and two transmembrane regions (TM1 and TM2), connected by a large extracellular loop. In order to form functional ion channels, P2X subunits have to assemble into homo- or heterotrimers. The aim of this study was to identify protein domains which play a role in the assembly of P2X subunits. I exploited the human P2X5 (hP2X5) subunit which in humans occurs mainly as a non-functional and non-assembling deletion variant lacking the pre-TM2 region and the outer half of TM2 as a result of splicing out of exon 10. By sequentially inserting the codons for the exon 10 amino acids and the characterization of the respective mutants by blue native PAGE, I could show that the assembly behaviour of the hP2X5 subunit is caused by the lack of the outer half of TM2. Additional scanning and deletion mutants led to the result that TM2 functions mainly as a hydrophobic anchor, stabilizing the correct topology and positioning of assembly domains without providing specific assembly information. This assembly information seems to be located in the ectodomain. The sole exception within TM2 is 355D which has a specific influence on the assembly of hP2X5 subunits. Single mutants in this region showed that only amino acids which are capable of forming interhelical hydrogen bonds via their side chain atoms are able to drive efficient trimer formation. This result suggests that 355D stabilizes the assembly of hP2X5 subunits by the formation of a hydrogen bond. Unfortunately, the search for an interaction partner of 355D in the first transmembrane domain by Cystein Crosslinking studies remained without a result, raising the possibility that the transmembrane domains may not be arranged in a “head to tail” orientation. Limited trypsinolysis of hP2X5 receptor mutants showed a close relationship between trimerization and resistance against proteolysis. This suggests that trimerizing P2X5 mutants are correctly folded while degradation by trypsin indicates a misfolding of the peptide. In addition to the hP2X5 subunits I also studied rat P2X1 (rP2X1) receptors. P2X1 constructs which consisted only of the ectodomains and a cleavable signal peptide were able to oligomerize partially, but they were not capable of forming defined trimers. The analysis of further constructs showed that both transmembrane regions are essential for an efficient trimerization without providing specific assembly information. A systematic alanine scanning of the whole ectodomain led to the result that the ectodomain contains multiple assembly domains. The identified regions have to be studied in more detail in further experiments. In an additional approach I studied chimeras which consisted of rP2X1- and rat P2X6 (rP2X6) subunits. Since rP2X6 subunits are not capable of trimerization they can be used to identify assembly domains by combining them with sequence elements of rP2X1 subunits. It could be shown that chimeras consisting of the ectodomain of rP2X1 subunits and the transmembrane domains and cytosolic regions of rP2X6 subunits trimerized efficiently while the vice versa construct did not. This strongly suggests that the essential assembly information of P2X subunits is located in the ectodomain. In conclusion, my results show that the transmembrane domains function mainly as hydrophobic membrane anchors, enabling the correct topology and positioning of assembly domains. The initial homotrimerization is stabilized by 355D which drives transmembrane helix association by the formation of a hydrogen bond, assisting the assembly via the most important assembly information which is located in the ectodomain.