Open Access

Frederik Lennart Schmidt

• In der vorliegenden Arbeit wurden die Proteine Vlp15/16 und GlpQ aus B. miyamotoi hinsichtlich ihrer Eigenschaft, mit Plasminogen zu interagieren, charakterisiert. Da einige Fälle von ZNS-Beteiligungen bei B. miyamotoi-Infektionen berichtet wurden, ist anzunehmen, dass diese Borrelienspezies über molekulare Mechanismen zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke verfügt. Eine solche Strategie könnte die Bindung wirtseigener Proteasen wie z.B. Plasminogen sein, um Komponenten der extrazellulären Matrix zu degradieren und dadurch die Dissemination des Erregers zu erleichtern. Während Vmps, zu welchen auch Vlp15/16 gehört, als membranständige Proteine durch Variation der antigenen Oberflächenmatrix zur Immunevasion des Erregers beitragen, ist GlpQ bei der Hydrolyse von Phospholipiden in den Zellstoffwechsel eingebunden. Trotz dieser unterschiedlichen Funktionen, die den beiden Proteinen zukommen, binden beide Moleküle Plasminogen. Die Eigenschaften dieser Interaktion wurden in dieser Arbeit im Detail untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass Vlp15/16 und GlpQ Plasminogen konzentrationsabhängig binden und die Dissoziationskonstanten (Vlp15/16:Kd = 354 nM ± 62 nM; GlpQ: Kd = 413 nM ± 72 nM) für beide Proteine im Bereich der Serumkonzentration von 2 µM liegen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass den beiden Proteinen unterschiedliche Mechanismen zugrunde liegen, Plasminogen zu binden. Während die erhobenen Daten für Vlp15/16 darauf hindeuten, dass Lysin-Reste essenziell für die Interaktion sind, scheinen bei GlpQ ionische Wechselwirkungen von Bedeutung zu sein. Um die Beteiligung von C-terminal lokalisierten Lysin-Resten für die PlasminogenBindung von GlpQ nachzuweisen, wurden Varianten mit einzelnen Lysin-Substitutionen an zwei unterschiedlichen Positionen (333 und 334) sowie eine Variante mit einer Zweifach-Substitution (GlpQ-K333A-K334A) generiert. Die Bindungsanalysen ergaben, dass insbesondere der Lysin-Rest an Position 334 bei der Interaktion mit Plasminogen beteiligt ist. Die funktionellen Analysen zeigten, dass das an Vlp15/16 beziehungsweise GlpQ gebundene Plasminogen zu Plasmin aktiviert werden konnte und darüber hinaus dazu in der Lage war, das physiologische Substrat Fibrinogen zu degradieren. Abschließend wurde die Plasminogen-Bindung an nativen B. miyamotoi-Zellen mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen Vlp15/16 und GlpQ als Plasminogen-bindende Proteine aus, mit deren Hilfe B. miyamotoi befähigt ist, Komponenten der extrazellulären Matrix zu degradieren und somit prinzipiell zur Dissemination des Erregers beizutragen.
• In this study, Vlp15/16 and GlpQ of B. miyamotoi were characterized regarding their ability to interact with plasminogen. As a few cases of CNS involvement have previously been reported for B. miyamotoi disease, it is reasonable to assume that B. miyamotoi developed strategies to cross the blood-brain barrier. One particular strategy involves acquisition of host proteases such as plasminogen to degrade components of the extracellular matrix to support dissemination of the pathogen. Vmps including Vlp15/16 are membrane-bound proteins that contribute to immune evasion of the pathogen by varying the composition of the outer surface. In contrast, GlpQ participates in cellular metabolism and hydrolyses phospholipids. Despite their different functions, both proteins are capable to bind plasminogen. The nature of the protein-protein interaction were investigated in more detail in this work. The data showed that Vlp15/16 and GlpQ bound plasminogen in a concentration-dependent manner and that the dissociation constants (Vlp15/16: Kd = 354 nM ± 62 nM; GlpQ: Kd = 413 nM ± 72 nM) for both proteins were in the range of 2 μM which corresponds to the concentration of plasminogen in serum. Furthermore, it could be demonstrated that both proteins differentially interact with plasminogen. While lysine residues in Vlp15/16 are essential for plasminogen binding, ionic interactions appeared to play a role for the interaction plasminogen with GlpQ. To demonstrate the involvement of C-terminal located lysine residues for plasminogen binding, GlpQ variants with single lysine substitutions at two different positions (333 and 334) and one variant with a double substitution (GlpQ- K333A-K334A) were generated. The data generated suggest that the lysine residue at position 334 is of relevance for the interaction with plasminogen. Further functional analyses revealed that plasminogen bound to Vlp15/16 and GlpQ, respectively, could be activated to plasmin and was also capable of degrading its physiological substrate fibrinogen. Finally, plasminogen binding to native B. miyamotoi cells could be detected by employing immunofluorescence microscopy. In sum, the collected data revealed Vlp15/16 and GlpQ as novel plasminogen-binding proteins of B. miyamotoi. Interaction with plasminogen enables B. miyamotoi to degrade components of the extracellular matrix and, thus could contribute in the dissemination of the pathogen.