Open Access

Martina Hartstock

• Die akustische Mikroskopie stellt ein neuartiges bildgebendes Verfahren zur zerstörungsfreien Werkstoffprüfung dar, das erst seit kurzem in der Medizin eingesetzt wird und bei dem reflektierte Ultraschallwellen zur Bilderzeugung verwendet werden. Auf diese Weise können neue Informationen bezüglich der Materialparameter des untersuchten Gewebes erlangt werden. Neben einer enorm großen Bandbreite an möglichen Auflösungen bietet diese Technik die Möglichkeit, opake Objekte zu durchdringen und ihr Inneres abzubilden. Durch seine nicht-destruktive Art und die Notwendigkeit einer Kopplungsflüssigkeit bietet diese mikroskopische Methode zudem die Option lebende Zellen und Gewebe zu untersuchen. Das Ziel der durchgeführten Arbeit war es, die Interpretation von akustischen Bildern des menschlichen Gewebes zu erleichtern. Zu diesem Zweck analysierten wir SAM-Abbildungen von Knochengewebe im Vergleich zu anderen Untersuchungsverfahren. Neben einer qualitativen Bewertung der Morphologie gleichartiger Strukturen wurden ausgedehnte morphometrische Messungen und energiedispersive Röntgenanalysen durchgeführt. Als Methoden für den qualitativen Vergleich wurden konventionelle mikroskopische Techniken wie Polarisations-, Fluoreszenz-, Durchlicht-, Auflicht- und Rasterelektronenmikroskopie sowie Mikroradiographie vergleichend verwendet. Der morphometrische Vergleich erfolgte zwischen ultraschall- und auflichtmikroskopisch erzeugten Abbildungen. Weiterhin wurde die Beziehung zwischen akustischen Grauwertdarstelllungen und energiedispersiven Röntgenanalysen bewertet. Als Untersuchungsmaterial dienten Mandibulaknochen von sieben Beagle-Hunden. Die Mandibula eines jeden Hundes wurde beidseits mittels Osteoskalpell nach Sachse (Bien Air, CH-Biel) und CO2-Laser (entwickelt im Center of Advanced European Studies and Research, D-Bonn) am Margo ventralis im unbezahnten Kieferabschnitt osteotomiert. Nach einer dreiwöchigen Heilungsphase wurden die Knochen entnommen und vor der Schnittfertigung in Polymethylmethacrylat eingebettet. Beim qualitativen Vergleich der Morphologie gleichartiger Strukturen fanden sich bei SAM-Abbildungen und bei Aufnahmen, die mit den anderen mikroskopischen Techniken erzeugt wurden, weitgehende Übereinstimmungen hinsichtlich gröberer morphologischer Merkmale wie Umriss, flächiger Ausdehnung und Lage von Perforationen. Diese Gemeinsamkeiten konnten sowohl an Kallusgewebe als auch an osteonalem Knochen beobachtet werden. Unterschiede fanden sich hinsichtlich feinerer morphologischer Merkmale wie der geometrischen Übereinstimmung im Detail und der flächigen Ausdehnung bei höherer Vergrößerung. Zudem stellte sich die Binnenstruktur von Kallus und osteonalem Knochengewebe differenzierter dar als mit Hilfe der anderen mikroskopischen Techniken. Morphometrische Messungen zeigten, dass Strukturen, die im Bereich des Osteotomiespalts gemessen worden waren, im Ultraschallbild tendenziell größer abgebildet werden als in Auflichtaufnahmen. Im Gegensatz dazu wurden Strukturen im Bereich des kortikalen Knochens im ultraschallmikroskopischen Bild eher unterschätzt. Diese Ungenauigkeit bei der Abbildung von Strukturen im Ultraschallbild lässt sich am ehesten dadurch erklären, dass durch unterschiedliche Eindringtiefen des Ultraschalls auch unterschiedlich dicke Ebenen der Probe abgebildet werden. Wird eine dickere Schicht der Probe durch das akustische Mikroskop dargestellt als durch das Auflichtmikroskop, so kann es zu einer Überschätzung der Strukturen kommen und umgekehrt. Anhand energiedispersiver Röntgenanalysen konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die Zunahme des Calcium- bzw. des Phosphorgehalts nicht alleine eine Aufhellung der Grautöne im Ultraschallbild verursachen kann. Auch der Vergleich mit Abbildungen der Elektronenmikroskopie ließ Unterschiede der Grauwerte erkennen. Demzufolge wird das akustische Bild nicht nur durch den Mineralgehalt, die Dichte und die atomare Zusammensetzung des Knochengewebes beeinflusst. Damit konnte mit der vorliegenden Untersuchung nachgewiesen werden, dass die Ultraschallmikroskopie ein neuartiges Verfahren darstellt, mit dem sich Knochen nicht nur in seiner Mikrostruktur morphologisch darstellen lässt, sondern mit der sich auch neuartige Informationen über funktionelle Parameter auf Nanoebene gewinnen lassen. Die Bedeutung dieser enormen Möglichkeiten sind im Moment noch nicht abschätzbar, weitere Untersuchungen müssen folgen.
• The acoustic microscopy represents a novel imaging technique for non-destructive material testing which has been applied recently in the medical area and regenerates figures by reflecting ultrasound-waves. Along this way new information about the material-parameters of the analysed tissue can be achieved. Beside a huge bandwidth of possible resolutions this technique offers the chance to permeate opaque samples and picture their interior. Due to its non-destructive nature and the need of coupling-fluid the opportunity arises to examine living cells and tissues by this microscopic method. The goal of our study was to facilitate the interpretation of acoustic images. For this purpose we analysed SAM-pictures of bone tissue in comparison to research methods. In addition to a qualitative evaluation of the morphology of similar structures extensive morphometric measurements and energy dispersive X-ray analysis were peformed. Conventional microscopic techniques as polarisation-, fluorescence-, transmitted-light-, reflected-light-, and scanning electron microscopy as well as microradiography were used as methods for the qualitative comparison. The morphometric comparison was conducted between acoustic images and pictures generated by reflected-light microscopy. Furthermore the relation between acoustic grayvalue-figures and energy dispersive X-ray analysis were evaluated. For all examinations samples of mandible bone of seven beagle-dogs were used. The mandibula of each canine was cutted by an Osteoskalpell by Sachse (BienAir, CH-Biel) and a CO2-Laser (Center of Advanced European Studies and Research, D-Bonn) at the margo ventralis in the non-toothed jaw-area. After a healing-time of three weeks the bone tissue were embedded for slicing in PMMA. The qualitative comparison of SAM images and pictures of the other microscopic techniques showed similarity regarding rough morphologic characteristics as outline, circumference and location of perforations. These similarities could be observed in callus tissue and cortical bone. Differences were found in respect to sligth morphologic criteria as geometric analogy in detail and two dimensional extension along with greater amplification. In addition the internal structure of callus and osteonal bone tissue presented theirselves more differentiated in SAM images than in pictures of other microscopic methods. Morphometric measurements revealed that structures measured in the osteotomy array tended to be displayed greater in SAM images than in reflected-lightmicroscope pictures. By contrast structures of cortical bone were underestimated by the SAM. We traced the overand underestimation of structures in SAM-images to the fact that depending on the different penetration depths of the ultrasound the displayed image plane varies. When a thicker layer of the specimen is imaged by the SAM than by the reflected-lightmicroscope a overestimation of the structure is possible to occure and vice versa. On the basis of energy dispersive X-ray analysis we showed that a grayvalue brightening in SAM pictures can not be caused only by an increasing content of calcium and phosphate, respectively. Additionally the comparison with electron microscope images revealed differences in gravalues. Thus SAM images are not only affected by the content of mineral, the density and the atomic number of the bone tissue. In conclusion the present study demonstrates that the ultrasound microscopy is a new method not only to image the morphologic structure of bone tissue on microscopic level but also to gain novel information about functional parameters on nano level. The importance of these tremendous possibilities is not assessable at the moment.