Open Access

Timo Mack

• Innerhalb der letzten 30 Jahre haben sich photoaktivierbare Verbindungen („caged compounds“) zu einem äußerst wertvollen Werkzeug entwickelt. Seit der erstmals publizierten Anwendung von lichtaktivierbarem ATP im Jahre 1978 durch Hoffman et al. konnten viele neue Erkenntnisse im Bereich der Physiologie, Molekularbiologie und Biochemie mit Hilfe von photoaktivierbaren Verbindungen gewonnen werden. Hierunter versteht man Substanzen, deren biologische Wirksamkeit temporär inaktiviert ist, jedoch durch Bestrahlung mit Licht wiederhergestellt werden kann. Die Inaktivierung wird durch spezielle, lichtreaktive Chromophore erreicht, sogenannten photolabilen Schutzgruppen („cages“). Der Einsatz dieser Technik zur Aktivierung von Nukleinsäuren eröffnet ein weites Feld an Anwendungsmöglichkeiten. So ist auf diese Weise eine orts- und zeitaufgelöste Kontrolle der Aktivität von z.B. Antisense-DNA, siRNA oder Aptameren durch Licht möglich. Während der vorliegenden Doktorarbeit konnten zwei neuartige photolabil geschützte Desoxythymidine als Phosphoramidite zum Einsatz in der automatisierten DNA-Synthese dargestellt werden. Hierfür wurden jeweils NDBF-OH bzw. pHP-OH in O4-Position der Nukleobase eingeführt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die beiden Nukleoside nach ihrem Einbau in DNA mittels UV-Licht entschützen lassen. Die photolabilen Schutzgruppen besaßen jedoch nur eine geringe chemische Stabilität unter verschiedenen basischen Abspaltbedingungen und sind deshalb nicht für die automatisierte DNA-Festphasensynthese unter Standardbedingungen geeignet. Durch Homologisierung der NDBF-Gruppe mit einer zusätzlichen Methyleneinheit zu hNDBF-OH wurde eine verbesserte Variante synthetisiert, welche eine ausreichende Basenstabilität und hervorragende photochemische Eigenschaften aufweist. Wie im Arbeitskreis Heckel gezeigt werden konnte, ist mittels in O6-Position hNDBF-modifiziertem Desoxyguanosin sowohl die DNA-Festphasensynthese unter Standardbedingungen möglich, als auch die spätere Photolyse dieser Schutzgruppe bei einer Wellenlänge von 420 nm. Hierdurch eröffnet sich zum ersten Mal die Möglichkeit, bei Verwendung von beispielsweise NPP und hNDBF, photolabil geschützte Bereiche in Nukleinsäuren wellenlängenselektiv durch Licht unterschiedlicher Wellenlänge zu aktivieren. In einem weiteren Projekt wurden erfolgreich photoaktivierbare Varianten des bivalenten Fusionsaptamers HD1-22 getestet. HD1-22 besitzt zwei Aptamerdomänen, HD1 und HD22, welche jeweils an eine der beiden Exosites I bzw. II von Thrombin binden. Im konkreten Fall konnten wir die Blutgerinnungsaktivität von Thrombin unter Verwendung einer photolabil geschützten Aptamersequenz von vollständig aktiv zu komplett inaktiv modulieren: Vor der UV-Bestrahlung war lediglich die Exosite II durch die HD22-Domäne blockiert. Dies erlaubte keinerlei Bindung des natürlichen Antikoagulans Antithrombin III an Thrombin – weder durch Heparin vermittelt noch ohne Beteiligung von Heparin. Der Zugang zur Exosite I war hingegen nicht eingeschränkt, die Blutgerinnungsaktivität des Thrombins somit durch die Rekrutierung von Fibrinogen an die Exosite I vollständig aktiv und nicht durch Antithrombin inhibierbar. Durch lichtvermittelte Entschützung der HD1-Domäne konnte nun eine Inaktivierung der Exosite I erfolgen, welche durch die hohe Bindungsaffinität der HD22-Aptamerdomäne stärker ausfiel als bei der ausschließlichen Verwendung eines HD1 Aptamers. Die koagulative Wirkung des Thrombins wurde somit vollständig aufgehoben. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der Grundstein für die Entwicklung eines kovalenten, lichtaktivierbaren Thrombin-Thrombinaptamer-Reagenzes gelegt. Dieses könnte zur gezielten Thromboembolisierung bei bestimmten malignen Tumorerkrankungen eingesetzt werden, um das entartete Gewebe von der Blut- und damit Nährstoffversorgung abzuschneiden. Zudem könnte so möglicherweise während einer Tumorexzision die Freisetzung von metastasierenden Krebszellen unterbunden werden. Das Reagenz besteht aus der von Heckel et al. publizierten „ausschaltbaren“ Variante des HD1-Aptamers. Diese besitzt einen photolabil geschützten Gegenstrang. Solange die Schutzgruppe intakt ist, bindet das Aptamer an die Exosite I von Thrombin und verhindert auf diese Weise die Rekrutierung von Fibrinogen. Wird die Sequenz jedoch mit UV-Licht bestrahlt, so erfolgt die Entschützung des Gegenstrangs und durch die folgende Basenpaarung eine Inaktivierung des HD1 Aptamers. Hieraus resultiert die Freisetzung von aktivem Thrombin, welches direkt zur Ausbildung eines Thrombus führt. Durch die – ebenfalls photospaltbare – kovalente Anbindung des „ausschaltbaren“ HD1 an die Proteinoberfläche werden eine vorzeitige Dissoziation des Aptamers und damit eine vorzeitige Wiederherstellung der Proteinaktivität verhindert.
• During the past three decades „caged compounds“ have become valuable tools in molecular biology as well as physiology and biochemistry. Starting with the publication of caged ATP by Hoffman et al. in 1978 a lot of important applications have been reported and the use of such caged compounds have led to new insights in how things work on cellular level. To achieve „caging“ the biological activity of a substance is masked using a photo-cleavable protecting group. As long as this group is attached to the substance its activity is blocked. Upon irradiation with basically UV-light, the activity is restored through cleavage of the photo-reactive protecting group. Thus, the method allows a spatiotemporal control of the action of biologically active molecules. Using caged variants of, for example, antisense-ODNs, siRNAs or aptamers lets one gain control of their action in time and space. Two new caged deoxythymidine phosphoramidites have been successfully synthesized during my doctorate. Therefor, NDBF- and pHP-chromophores respectively were used as photo-labile protecting groups and introduced at O4-position of thymine. Both nucleosides have been shown to be suitable in standard solid-phase DNA synthesis on an automated synthesizer and were proven to become uncaged by irradiation with UV-light. Unfortunately, the use is limited due to an elevated base lability of the caging groups during the cleavage process from the solid support. By developing a new NDBF-homologue hNDBF the problem of base-lability could be solved. The introduction of an additional methylene moiety increased the base-stability without altering the excellent photochemical properties of the nitrodibenzofurane chromophore. Furthermore, in our group it could be shown, that a deoxyguanosine modified with hNDBF in O6-position is stable under automated DNA-synthesis and subsequent basic cleavage conditions. The hNDBF-group was cleaved successfully at 420 nm UV-light irradiation, whereas in contrast for example NPP shows extremely low photo-reactivity at this wavelength. These results suggest that it could be possible for the first time to use a chromophore like NPP, which shows low absorption at wavelengths beyond ~400 nm and hNDBF for protection of different regions of a biologically active nucleic acid and thus for wavelength-selective uncaging. For a second project, caged variants of the thrombin binding bivalent fusion aptamer HD1-22 were synthesized and successfully used for the differential regulation of protein subdomain activity. HD1-22 consists of two different aptamer regions linked via a poly-adenine linker. By caging one of these domains, we could modulate the coagulation activity of thrombin from completely inactive to fully active. Before UV-irradiation, the non caged HD22 domain of Sequence G6 binds to the protein exosite II, thus inhibiting the binding of heparine. Heparine usually dramatically accelerates the recruitment of antithrombin III, a very potent inactivator of thrombin. Simultaneous caging of the HD1 region allowed no binding of the aptamer to exosite I. Therefore, the coagulatory protease activity and processing of fibrinogen into fibrin was fully switched on. However, irradiation with UV-light led to uncaging of the HD1 domain, resulting in its binding and inhibition of thrombin‘s exosite I. This means, that it was no longer possible for fibrinogen to bind to the exosite I – the coagulatory activity was therefore completely switched off upon irradiation. In a third project, the way for the development of a covalent, light-activatable thrombin/thrombin aptamer reagent (TTA) could be paved. By using the already published „off-switchable“ variant of HD1 and a photo-reactive linker it was possible to create a covalent and light-cleavable complex of the aptamer bound to exosite I and presumably lysine residues on the surface of thrombin. The covalent connection prevents the HD1 from dissociation which otherwise would result in an unwanted release of active thrombin. Upon light-irradiation two things happen: first, the NPE-group is cleaved from the antisense region of the HD1 resulting in base-pairing and depletion of the active conformation. Second, the covalent linker is cleaved as well, which allows dissociation of the inactivated aptamer and release of active thrombin. It is suggested, that such a TTA complex can be used by physicians for thromboembolization during tumor excision and thereby prevent metastatic cancer cells from entering the blood stream. Additionally, a systemic application of the TTA reagent as a prodrug and subsequent irradiation of the capillary vessels around – for example – light-accessible skin cancer could induce the formation of blood clots which cuts off the tumor from essential nutrient supply.