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Lukas Schimunek

• Trauma ist in Deutschland und weltweit eine der häufigsten Todesursache bei Personen unter 55 Jahren. Eine traumatische Verletzung von Gewebe führt zur Freisetzung von sogenannten damage-associated molecular patterns (DAMPs), die eine Entzündungskaskade auslösen, welche die Organfunktion negativ beeinträchtigt. Dies führt bei anhaltender Entzündung zunächst zu Organdysfunktion, was im weiteren Verlauf zu Organversagen führt und im Spätstadium im multiplen Organversagen (MOF) enden kann. In den meisten Fällen ist die inflammatorische Antwort des Immunsystems auf das Trauma adäquat und entspricht einem gut koordinierten Netzwerk von Immunzellen, Zytokinen und Chemokinen, welches zur Wiederherstellung des geschädigten Gewebes führt. Wenn dieses Netzwerk jedoch nicht im Gleichgewicht ist, kann die Entzündungsreaktion durch eine sogenannte feed-forward-loop von Inflammation und Gewebeschäden verstärkt werden. Wenn dieser Prozess systemisch wird, spricht man vom systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Auf der anderen Seite gibt es ein Gegenstück zu SIRS, nämlich das sogenannte compensatory anti-inflammatory response syndrome (CARS). Auch ein Überschießen von CARS kann den Verlauf der posttraumatischen Inflammation negativ beeinträchtigen. Sowohl eine Verschiebung in Richtung von SIRS als auch in Richtung von CARS kann zu Organfunktionsstörungen, nosokomialen Infektionen und letztendlich zum Tod führen. Daher ist eine ausgeglichene, frühe posttraumatische Immunantwort für ein gutes Outcome von entscheidender Bedeutung. Monozyten nehmen eine kritische Stellung sowohl in der primären Immunantwort nach Trauma als auch nach Infektion ein. Durch die Oberflächenexpression von diversen sogenannten pattern-recocnition receptors (PRRs), insbesondere Toll-Like-Rezeptoren (TLRs), können Monozyten Pathogene und sogenannte pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) erkennen und neutralisieren. Darüber hinaus können Monozyten PAMPs über major histocompatibility complex class II -Moleküle (MHC-II) dem adaptiven Immunsystem präsentieren und somit als zelluläre Verbindung zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem fungieren. TLR2, eine Untergruppe der TLRs, ist einer der Hauptrezeptoren für PAMPs von grampositiven Bakterien wie S. aureus, dem Hauptkeim für posttraumatische Wundinfektionen und nosokomiale Infektionen. Es gibt immer noch keinen Konsens über den Einfluss von Trauma auf die Funktion von Monozyten und deren Expressionsprofil von PRRs und MHC-II-Molekülen nach einem Trauma. Verschiedene Studien berichten von einer beeinträchtigten TLR2-Expression bei Monozyten nach Trauma, während sich in anderen Studien eine konstante oder sogar erhöhte TLR2-Expression bei Monozyten nach Trauma gezeigt hat. Die Daten sind auch in Bezug auf die posttraumatische Phagozytoseleistung von Monozyten unbeständig. Während in einigen Studien im frühen posttraumatischen Verlauf im Vergleich zu gesunden Probanden von einer erhöhten Anzahl zirkulierender Monozyten mit erhaltener Phagozytoseleistung berichtet wird, zeigten andere Studien eine verminderte Phagozytoseleistung von Monozyten nach Trauma. Darüber hinaus gibt es widersprüchliche Ergebnisse bezüglich der Fähigkeit von Monozyten, proinflammatorische Zytokine wie Interleukin (IL)-1β oder Tumor necrosis factor (TNF)-α freizusetzen. Zusammengefasst ist die derzeitige Studienlage widersprüchlich. Zusätzlich wurde es in bisherigen Studien verpasst, die Kombination verschiedener Aspekte wie die Funktionalität der Monozyten in Bezug auf Phänotypisierung oder funktioneller Assays und deren Beobachtung über einen längeren Zeitraum miteinzubeziehen. Die unterschiedlichen Ergebnisse der bisherigen Studien könnte durch die Natur des Polytraumas bedingt sein, beispielsweise durch verschiedene Verletzungsmuster und Verletzungsschwere, die unterschiedliche Erstversorgung am Unfallort, die Zeit bis zur Ankunft in der Notaufnahme oder die unterschiedliche primäre und definitive Versorgung der Verletzungen. All das kann zu einer unterschiedlichen Antwort des Immunsystems und somit zu unterschiedlichen Outcomes führen. Daher war es Ziel unserer Studie, die oben genannten Variablen zu eliminieren, und eine kontrollierte Polytraumastudie am Schweinemodell durchzuführen, um die Funktionalität von Schweinemonozyten über einen Zeitraum von 72 Stunden nach Trauma zu untersuchen. Zusätzlich und im Gegensatz zu früheren Studien haben wir die Phänotypisierung von Monozyten (TLR2 und MHC-II [SLA-DR]) mit einem funktionellen Phagozytose-Assay kombiniert und deren direkte Assoziation in einem unabhängigen Assay analysiert. Peripheres Blut wurde vor (-1h) und direkt nach der Induktion des Polytraumas (PT) (0h) entnommen, sowie 3,5h, 5,5h, 24h und 72h später. Die Expression von H(S)LA-DR und TLR2 auf Schweine-Monozyten wurde untersucht. Außerdem wurde die Phagozytierungsaktivität von Schweinemonozyten gemessen. Darüber hinaus wurden aus mechanistischen Gründen Blutproben von 10 gesunden Schweinen zunächst einem TLR2-neutralisierenden Antikörper und anschließend S. aureus-Partikeln ausgesetzt, bevor die Phagozytoseleistung der Monozyten untersucht wurde. Die Anzahl der CD14 + -Monozyten aller zirkulierenden Leukozyten blieb während des Beobachtungszeitraums konstant, während der Prozentsatz der CD14 + H(S)LA-DR + -Monozyten direkt, 3,5h und 5,5h nach dem Trauma signifikant abnahm. Der Prozentsatz von TLR2 + exprimierenden Zellen aus allen Monozyten verringerte sich direkt, 3,5h und 5,5h nach dem Trauma signifikant. Der Prozentsatz der phagozytierenden Monozyten nahm direkt nach Trauma ab und blieb in den ersten 3,5 Stunden nach dem Trauma niedriger, stieg jedoch nach 24 Stunden an. Die Antagonisierung von TLR2 verringerte signifikant die Phagozytoseleistung der Monozyten. Sowohl der verringerte Prozentsatz der aktivierten als auch der TLR2-exprimierenden Monozyten blieb bestehen, solange die verringerte Phagozytoseleistung beobachtet wurde. Darüber hinaus führte auch die Neutralisation von TLR2 zu einer verminderten Phagozytoseleistung. Daher nehmen wir an, dass eine verringerte TLR2-Expression für die verringerte Phagozytoseleistung verantwortlich ist.
• Trauma is one of the leading causes of death in Germany and worldwide for individuals under 55 years old. Traumatic tissue injury leads to the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs), which induces an inflammatory cascade, and which is considered to diminish organ function. This leads to organ failure and subsequently to multiple organ failure (MOF). In most cases, the inflammatory response is appropriate in its extent, and the injury-induced inflammation is a well-coordinated network of immune cells, cytokines, and chemokines, which leads to tissue resolution. However, if that network is out of balance, the inflammatory response can become augmented by a feed-forward loop of inflammation and tissue damage. If this process becomes systemic, it is called systemic inflammatory response syndrome (SIRS). On the other hand, there is a counterpart to SIRS, namely compensatory anti-inflammatory response syndrome (CARS). However, an overshooting CARS can impair the post-traumatic inflammatory course. Both deranged responses can lead to organ dysfunction, nosocomial infections and, ultimately, death. Thus, a well-balanced, early post-traumatic immune response is crucial for a good outcome. Monocytes are major players in the primary immune response after trauma as well as after infection. Being equipped with multiple pattern recognition receptors (PRRs), notably Toll-Like Receptors (TLRs), Monocytes are capable of recognizing pathogens and pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), and subsequently neutralize them. Moreover, monocytes are able to present PAMPs to the adaptive immune system via Major Histocompatibility Complex Class II (MHC-II) molecules and act therefore as a cellular link between the innate and the adaptive immune system. TLR2 is one of the main receptors for PAMPs of gram-positive bacteria, such as S. aureus, the major bacterium of post-traumatic wound infection and nosocomial infection. There is still no consensus on the impact of traumatic injury onto the function of monocytes and their expression pattern of PRRs and MHC-II molecules after trauma. There are reports of impaired TLR2 expression on monocytes after trauma, as well as reports of constant and even increased expression of TLR2 on monocytes in trauma patients. The data is also inconsistent regarding the post-traumatic phagocytic function of monocytes. While some of the previous studies reported an increased number of circulating monocytes with preserved phagocytic capability in the early post-traumatic course of trauma patients compared to healthy volunteers, other studies showed a diminished phagocytic function of monocytes after trauma. Furthermore, there are contradictory results on the monocytic ability to release pro-inflammatory cytokines, such as Interleukin (IL)-1β or Tumor necrosis factor (TNF)-α. Taken together, there is still a tremendous dissent across recent studies and a lack of both combining different aspects of monocytic functionality such as phenotyping or functional assays and observing them over an extended period of time. The dissent of recent studies might be due to the uncontrollable nature of polytrauma like the varying pattern of injuries, the first care at the scene of accident, the passing time until the arrival at the emergency room and the final care of the injuries. All this can lead to different reactions of the immune system and therefore different post-traumatic outcomes. Therefore, we sought to eliminate the mentioned variables and conducted a well-controlled porcine large animal polytrauma study to investigate the post-traumatic functionality of porcine monocytes over a time course 72h after trauma. Additionally, and in contrast to previous studies, we combined phenotyping of monocytes (TLR2 and MHC-II [SLA-DR]) with a functional phagocytosis assay and analyzed their direct association in an independent assay. Peripheral blood was withdrawn before (-1h) and directly after induction of polytrauma (PT) (0h), as well as 3.5h, 5.5h, 24h and 72h after trauma. The expression of MHC-II (SLA-DR) and TLR2 on porcine monocytes were investigated. Additionally, the phagocytizing activity of porcine monocytes was measured. Furthermore, for mechanistic purposes, blood samples from 10 healthy pigs were exposed to a TLR2-neutralizing antibody and subsequently to S. aureus particles before phagocytizing activity of the monocytes was measured.