Open Access

Nicole Weis

• Macrophages show a remarkable functional plasticity, which enables them to change their phenotype in response to environmental signals. They are key players during infection by initiating inflammation through the release of proinflammatory mediators. Furthermore, macrophages contribute to the resolution of inflammation by phagocytosis of apoptotic granulocytes. Phagocytosis of apoptotic cells (AC) induces an anti-inflammatory phenotype in macrophages and protects them against apoptosis. However, mechanistic details provoking these phenotype alterations are incompletely understood. Therefore, the aim of my Ph.D. thesis was to investigate the molecular basis of anti-inflammatory macrophage polarization. In the first part of my studies, I investigated the expression of heme oxygenase (HO)-1 in macrophages following treatment with supernatants from AC. HO-1 catalyzes the first and rate-limiting step of heme degradation and potentially bears anti-inflammatory as well as anti-apoptotic potential. I was able to show biphasic upregulation of HO-1 by AC supernatants. The first phase of HO-1 induction at 6 h required activation of p38 MAPK and was accomplished by the bioactive lipid sphingosine-1-phosphate (S1P) engaging S1P receptor 1 (S1P1). However, the second wave of HO-1 induction at 24 h was attributed to autocrine signaling of vascular endothelial growth factor (VEGF) A, whose expression was facilitated by S1P. The release of VEGFA from macrophages was STAT1-dependent, whereas VEGFA itself acted on the macrophage HO-1 promoter via STAT1/STAT3 heterodimer binding. Knockdown of HO-1 revealed its relevance in promoting enhanced expression of the anti-apoptotic proteins B cell leukemia/lymphoma-2 (Bcl-2) and B cell leukaemia/lymphoma-x long (Bcl-XL), as well as the anti-inflammatory adenosine receptor A2A. MHC II and indoleamine 2,3-dioxygenase expression were also affected by ACsupernanatants, but were not HO-1 dependent. Unexpectedly, S1P1 was also upregulated following treatment with AC supernatants. Thus, I considered whether S1P1 induction could specifically be mediated by alternative macrophage activating factors. The expression of S1P1 was enhanced in the presence of the alternative activation stimuli IL-4 as well as IL-10, whereas it was unchanged following incubations with LPS, interferon-g or S1P. My next aim was to investigate the expression of the different S1P receptor isoforms in macrophages following treatment with supernatants form AC. While the expressions of S1P1 as well as S1P3 were induced by exposure to supernatants from AC, S1P2 expression was unaffected. As S1P1/3 and S1P2 are conflictively involved in the regulation of cell migration, I asked for a correlation between increased S1P receptor expression and enhanced migration rate. Indeed, macrophages showed enhanced motility following treatment with supernatants form AC, which was inhibited in S1P1 knockout macrophages. In summary, my findings indicate that HO-1, which is induced by AC-derived S1P, is critically involved in macrophage polarization towards an alternatively activated macrophage phenotype. S1P1 seems to represent a central checkpoint during macrophage activation. On the one hand, S1P1 is induced by supernatants form AC and promotes migration of macrophages. On the other hand, it mediates the induction of HO-1, which is accompanied by antiinflammatory as well as anti-apoptotic signaling. Furthermore, my studies provide evidence that upregulation of HO-1 and S1P1 in macrophages may contribute to the resolution of inflammation by establishing an anti-inflammatory macrophage phenotype and provoking macrophage migration along the vascular S1P gradient out of an inflammatory environment into the lymph.
• Makrophagen weisen eine bemerkenswerte funktionelle Plastizität auf, welche es ihnen ermöglicht, ihren Phänotyp als Antwort auf Umweltreize zu ändern. Sie spielen eine zentrale Rolle während der Infektion, indem sie die Entzündungsreaktion durch die Freisetzung von pro-inflammatorischen Mediatoren initiieren. Darüber hinaus tragen Makrophagen durch die Phagozytose apoptotischer Zellen zur Auflösung der Entzündung bei. Phagozytose von apoptotischen Zellen induziert einen anti-inflammatorischen Phänotyp in Makrophagen und schützt sie vor Apoptose. Jedoch sind die mechanistischen Details, welche diese Phänotyp-Veränderungen bewirken, nur unvollständig bekannt. Daher war es das Ziel meiner Doktorarbeit, die molekulare Basis der anti-inflammatorischen Makrophagen-Polarisierung zu untersuchen. Im ersten Teil meiner Studien untersuchte ich die Expression der Häm-Oxygenase (HO)-1 in Makrophagen nach Behandlung mit Überständen von apoptotischen Zellen. Die HO-1 katalysiert den ersten und limitierenden Schritt des Häm-Abbaus und weist anti-inflammatorisches sowie anti-apoptotisches Potential auf. Ich war in der Lage eine biphasische Induktion der HO-1 durch Überstände von apoptotischen Zellen zu zeigen. Die erste Phase der HO-1-Induktion nach 6 h erforderte die Aktivierung der p38 MAPK und wurde durch Interaktion des bioaktiven Lipids Sphingosin-1-Phosphat (S1P) mit dem S1P-Rezeptor 1 (S1P1) vermittelt. Die zweite Welle der HO-1-Induktion nach 24 h war dem „vascular endothelial growth factor“ (VEGF) A zuzuschreiben, dessen Expression durch S1P ausgelöst wurde. Während die Freisetzung von VEGFA aus Makrophagen STAT1-abhängig war, wirkte VEGFA autokrin über STAT1/STAT3-Heterodimer-Bindung auf den HO-1-Promotor. Ein Knockdown der HO-1 enthüllte ihre Bedeutsamkeit für der Förderung der Expression der anti-apoptotischen Proteine „B cell leukemia/lymphoma-2“ (Bcl-2) und „B cell leukaemia/lymphoma-x long“ (Bcl-XL) sowie des anti-inflammatorischen Adenosin-Rezeptors A2A. Die Expression des MHC II und der Indolamin 2,3-dioxygenase wurden auch von Überständen von apoptotischen Zellen beeinflusst, waren aber nicht HO-1-abhängig. Unerwartet war auch der S1P1 nach Behandlung mit Überstanden von apoptotischen Zellen hochreguliert. Folglich erwägte ich, ob die Induktion des S1P1 spezifisch durch Faktoren vermittelt werden konnte, welche Makrophagen alternativ aktivieren. Die Expression des S1P1 war in Gegenwart der alternativ aktivierenden Stimuli IL-4 und IL-10 gesteigert, hingegen war sie nach Inkubation mit LPS, Interferon-g oder S1P unverändert. Mein nächstes Ziel war es, die Expressionsrate der verschiedenen S1P-Rezeptor-Isoformen in Makrophagen nach Behandlung mit Überständen von apoptotischen Zellen zu untersuchen. Während die Expression des S1P1 sowie des S1P3 durch Stimulation mit Überständen von apoptotischen Zellen induziert waren, war die Expression des S1P2 unberührt. Da der S1P1/3 und der S1P2 gegensätzlich in die Regulation der Zell-Migration involviert sind, fragte ich nach einer Korrelation zwischen der erhöhten S1P-Rezeptor-Expression und einer gesteigerter Migrationsrate. In der Tat, wiesen Makrophagen nach Behandlung mit Überständen von apoptotischen Zellen eine gesteigerte Motilität auf, welche in S1P1-Knockout-Makrophagen gehemmt war. Zusammenfassend zeigen meine Entdeckungen, dass die HO-1, welche durch von apoptotischen Zellen freigesetztes S1P induziert wird, kritisch in die Makrophagen-Polarisierung in Richtung eines alternativ-aktivierten Makrophagen-Phänotyps involviert ist. S1P scheint einen zentralen Kontrollpunkt während der Makrophagen-Aktivierung darzustellen. Einerseits wird der S1P1 durch Überstände von apoptotischen Zellen induziert und fördert die Migration der Makrophagen. Andererseits vermittelt er die Induktion der HO-1, welche anti-inflammatorische sowie anti-apoptotische Antworten auslöst. Darüber hinaus liefern meine Studien Hinweise dafür, dass die Induktion der HO-1 und des S1P1 in Makrophagen die Etablierung eines antiinflammatorischen Makrophagen-Phänotyps und das Auslösen von Makrophagen-Migration entlang des vaskulären S1P-Gradienten aus der entzündlichen Umgebung in die Lymphe bewirkt, und somit zur Auflösung einer Entzündung beitragen kann.