Open Access

Rebekka Bauer

• Molecular oxygen (O2) is essential for numerous metabolic processes. Not surprisingly, hypoxia and the resulting adaptations play a pivotal role in pathophysiology, e.g., in cancer or in inflammatory diseases. Of note, myeloid cells are known to accumulate in hypoxic regions such as tumor cores or rheumatoid arthritis joints and may contribute to disease progression. While most studies so far concentrated on transcriptional adaptation by the hypoxia-inducible factors (HIF) 1 and 2 under short term hypoxia, prolonged oxygen deprivation and alternative post-transcriptional regulation are rather poorly investigated. Consequently, the aim of the study was to generate a comprehensive overview of mRNA de novo synthesis and degradation and its contribution to total mRNA changes in monocytic cells in the course of hypoxia. To this end, I used thiol-linked alkylation for the metabolic sequencing of RNA (SLAM-Seq) to characterize RNA dynamics under hypoxia. Specifically, I labeled monocytic THP-1 cells under normoxia (N), acute hypoxia (AH; 8 h 1% O2), or chronic hypoxia (CH; 72 h 1% O2) with 4-thiouridine (4sU), which allows for transcriptome-wide identification of de novo synthesized mRNAs and estimation of their half-lives. Total mRNA expression analyses revealed that most changes occurred under CH. Considering that HIF accumulation and resulting transcriptional regulation was shown to decline again under CH, I further analyzed the impact of RNA stability on gene expression. I observed a global reduction in RNA half-lives under hypoxia, indicative for the attenuation of energy-consuming protein synthesis upon oxygen deprivation. Moreover, I observed a subgroup of hypoxic destabilized transcripts with resulting decreased mRNA expression under CH, which consisted of 59 nuclear-encoded mitochondrial mRNAs. This might prevent futile production of new mitochondria under conditions, where mitochondria are even actively degraded to prevent production of detrimental reactive oxygen species. While stability-regulated transcripts were mainly destabilized under hypoxia, the vast majority of differentially de novo synthesized transcripts were upregulated. Functional analyses revealed not only hypoxia, but also cholesterol homeostasis and inflammatory response as top enriched terms, corroborating findings on total mRNA level. Focusing on hypoxia-altered cholesterol metabolism, I observed an 9 accumulation of early and a decrease in late cholesterol precursors, which are separated by several oxygen-dependent enzymatic steps. Although total cholesterol levels were only slightly reduced, my data indicate locally lowered endoplasmic reticulum (ER) cholesterol levels under hypoxia, which cause feedback activation of the ER cholesterol-sensing transcription factor sterol regulatory element-binding protein 2 (SREBP2) and induction of cholesterol biosynthesis enzymes. Interestingly, a broad range of interferon-stimulated genes (ISGs), mainly known for their antiviral function, was also induced under hypoxia with similar kinetics as SREBP2 targets, suggesting an immunometabolic crosstalk. While the availability of certain cholesterol biosynthesis intermediates as well as a direct involvement of SREBP2 seemed rather unlikely to cause hypoxic ISG induction, changes in intracellular cholesterol distribution appeared crucial for the hypoxic induction of chemokine-ISGs. Mechanistically, I found that MyD88-dependent toll-like receptor 4 (TLR4) signaling contributes to enhanced hypoxic ISG induction, likely sensitized by changes in cholesterol dynamics. Importantly, hypoxia amplified induction of chemokine-ISGs in monocytes upon treatment with severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2) spike protein via TLR4 similarly as after addition of infectious virus, which might contribute to systemic inflammation in hypoxemic patients with severe coronavirus disease-2019 (COVID-19). Taken together, I comprehensively analyzed RNA dynamics in hypoxic monocytes. Specifically, I identified RNA stability as a modulating mechanism to limit production of mitochondria under oxygen-restricted conditions. Moreover, I characterized the immunometabolic crosstalk between disturbed cholesterol homeostasis and spontaneous induction of interferon (IFN)-signaling in hypoxic monocytes, which might contribute to systemic inflammation in severe cases of COVID-19.
• Molekularer Sauerstoff (O2) ist für zahlreiche Stoffwechselvorgänge unerlässlich. Dementsprechend ist ein Zusammenhang zwischen reduzierter Sauerstoffverfügbarkeit, d.h. Hypoxie, den resultierenden Anpassungen und pathophysiologischen Prozessen wie der Entstehung von Krebs oder entzündlichen Erkrankungen nicht verwunderlich. Zudem ist bekannt, dass myeloide Zellen in hypoxischen Regionen, wie schlecht durchbluteten Tumorbereichen, oder in entzündeten Gelenken, z.B. bei der rheumatoiden Arthritis, akkumulieren, wo sie zum Fortschreiten der Krankheit beitragen können. Während sich die meisten Studien bislang auf transkriptionelle Anpassung durch die Hypoxie-induzierbaren Faktoren (HIF) 1 und 2 unter akuter Hypoxie konzentrierten, sind anhaltender Sauerstoffmangel und alternative posttranskriptionelle Regulationsmechanismen bisher weniger gut verstanden. Ziel meiner Studie war es daher, die de novo Synthese und den Abbau von mRNAs und die resultierenden Konsequenzen auf die mRNA-Expressionslevel in Monozyten unter Hypoxie umfassend zu charakterisieren. Um die RNA-Dynamik unter Hypoxie zu untersuchen, habe ich in monozytären THP-1-Zellen unter Normoxie (N), akuter Hypoxie (AH; 8 h 1% O2) oder chronischer Hypoxie (CH; 72 h 1% O2) mittels metabolischer RNASequenzierung Transkriptom-weit de novo synthetisierte mRNAs identifiziert und deren Halbwertszeiten bestimmt. Expressionsanalysen der Gesamt-mRNA zeigten, dass die meisten Veränderungen erst unter CH auftraten. Da zudem bekannt ist, dass HIF-vermittelte Transkriptionsveränderungen unter CH abnehmen, habe ich zunächst den Einfluss von RNA-Stabilität auf die Genexpression analysiert. Dabei beobachtete ich eine globale Reduktion der RNA-Halbwertszeit unter Hypoxie, was möglicherweise eine generelle Verringerung Energie-verbrauchender Proteinbiosynthese zur Folge hat. Außerdem identifizierte ich eine Untergruppe hypoxisch-destabilisierter Transkripte, bestehend aus 59 Kern-kodierten mitochondrialen mRNAs, deren Gesamt-mRNA-Expression vermutlich infolgedessen unter CH ebenfalls abnahm. Dies könnte auf einen protektiven Mechanismus hindeuten, der eine reduzierte Produktion von Mitochondrien zur Folge hat, wenn diese sogar aktiv abgebaut werden, um die Generierung reaktiver Sauerstoffspezies zu limitieren. Während durch ihre Halbwertszeit regulierte Transkripte unter Hypoxie hauptsächlich destabilisiert wurden, war die Mehrheit der differentiell de novo synthetisierten mRNAs hochreguliert. Dabei waren mit Hypoxie, Cholesterin-Homöostase und Entzündungsreaktionen assoziierte Transkripte am stärksten angereichert. Zunächst fokussierte ich mich auf den veränderten Cholesterin-Stoffwechsel und beobachtete eine Akkumulation von frühen und eine Abnahme von späten Cholesterin-Vorläufern, die durch mehrere Sauerstoff-abhängige Schritte verbunden sind. Außerdem weisen meine Daten auf lokal erniedrigte Cholesterin-Mengen am endoplasmatischen Retikulum (ER) unter Hypoxie hin, die für die Aktivierung des ER-Cholesterin-regulierten Transkriptionsfaktors Sterol-regulatorisches Element-bindendes Protein 2 (SREBP2) und die Induktion von Cholesterin-Biosynthese-Enzymen verantwortlich sind. Interessanterweise wurden unter Hypoxie zusätzlich zu den SREBP2-regulierten mRNAs mit ähnlicher Kinetik viele Interferon-stimulierte Gene (ISG) induziert, was auf eine immunmetabolische Wechselwirkung hindeutet. Während sich die Verfügbarkeit bestimmter Cholesterin-Vorstufen sowie die SREBP2-Aktivität als irrelevant für die hypoxische ISG-Induktion darstellten, schien eine modifizierte intrazelluläre Cholesterin-Verteilung entscheidend für die hypoxische Chemokin-ISG-Induktion zu sein. Meine Daten weisen darauf hin, dass Veränderungen in der Cholesterin-Dynamik zu einer verstärkten MyD88-abhängigen TLR4 (toll-like receptor 4)-Signaltransduktion führen, die für die hypoxische ISG-Induktion wichtig ist. Außerdem amplifizierte Hypoxie die Chemokin-ISG-Induktion in Monozyten nach Kontakt mit SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2) Spike-Protein über TLR4 ähnlich stark wie nach Zugabe von infektiösem Virus, was zu systemischer Entzündung in hypoxämischen Patienten mit schwerer COVID-19 (corona virus disease 2019)-Erkrankung beitragen könnte. Zusammenfassend analysierte ich die RNA-Dynamik unter Sauerstoffmangel umfassend. Ich identifizierte RNA-Stabilität als einen modulierenden Faktor, der die Mitochondrien-Produktion unter Hypoxie limitiert. Außerdem charakterisierte ich die immunmetabolische Interaktion zwischen gestörter Cholesterin-Biosynthese und spontaner ISG-Induktion in hypoxischen Monozyten, die in schweren COVID-19-Verläufen zu systemischer Entzündung beitragen könnte.