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Siamak Sadeghi Naini

• Das Hepatitis C-Virus (HCV) ist ein umhülltes RNA-Virus, das der Virusfamilie Flaviviridae angehört. Fast alle immunkompetenten Patienten bilden während einer HCV-Infektion multispezifische T-Zell-Antworten und neutralisierende Antikörper gegen verschiedene HCV-Hüllglykoproteine. Trotzdem sind sie nicht in der Lage, das Virus erfolgreich zu eliminieren. Etwa 70% der HCV-infizierten Patienten entwickeln eine chronische Infektion, die zu einer progressiven Leberschädigung führen kann. Aufgrund des Fehlens einer geeigneten in vivo oder in vitro Neutralisationsuntersuchung ist wenig über die humorale Immunantwort bzw. die Rolle und Bedeutung der neutralisierenden Antikörper bei der HCV-Infektion bekannt. Ein lang ersehntes Ziel in der HCV-Forschung ist die Entwicklung eines verlässlichen Virus-Systems zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Zielzellen und HCV-Hüllglykoproteinen. In meiner Studie wurde die humorale Immunantwort bei 31 chronisch HCV-infizierten Patienten unter Anwendung von Hepatitis C-Pseudopartikeln (HCVpp) untersucht. Die untersuchten Patienten waren mit unterschiedlichen HCV-Genotypen infiziert, befanden sich zum Zeitpunkt der Untersuchung (Probeentnahme) in keiner Therapie und wiesen keine HIV- oder HBV-Koinfektion auf. Als Negativ-Kontrolle standen mir die Serum-Proben von 5 gesunden Probanden zur Verfügung. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass man durch die Anwendung von Hepatitis C-Pseudopartikeln neutralisierende Antikörper bei chronisch HCV-infizierten Patienten nachweisen kann. Gesunde Probanden hingegen wiesen keine neutralisierenden Antikörper auf. Die zur Untersuchung der humoralen Immunantwort hergestellten HCV-Pseudopartikel hatten den Genotyp 1a. Die Serum-Proben der untersuchten Patienten in meiner Studie waren mit HCV-Genotypen infiziert, die sich zum Teil von dem eingesetzten HCVpp-Genotyp unterschieden. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Serum- Proben die Infektiösität der HCVpp mit nahezu gleicher Wirksamkeit reduzierten wie die Serum-Proben von Patienten, die mit dem HCV-Genotyp 1a infiziert waren (kreuzreaktive Eigenschaft der neutralisierenden Antikörper). Im letzten Teil dieser Arbeit wurden die antikörpervermittelte Virusneutralisation und die CD4+- und CD8+-T-Zell-Stimulation bei 22 chronisch HCV-infizierten Patienten gleichzeitig miteinander verglichen. In meiner Studie zeigten 11 Patienten eine starke, 9 Patienten eine schwache und 2 Patienten keine HCV-Neutralisation. Die Ergebnisse der Virusneutralisation waren unabhängig von den Ergebnissen der T-Zell-Stimulation und den HCV-Genotypen. Auch bei fehlender T-Zell- Antwort konnte eine Neutralisation beobachtet werden. Das untersuchte Patientenkollektiv bestand hauptsächlich aus Patienten mit einer chronischen HCV-Infektion, die weder zum Zeitpunkt der Untersuchung (Probeentnahme) noch anamnestisch eine Therapie unterzogen waren. Es gab lediglich zwei therapierte Patienten, die HCV-positiv (Non-Responder) waren. Sie zeigten beide eine starke Neutralisation bei starker CD8+-T-Zell-Antwort aber schwacher bzw. fehlender CD4+-T-Zell-Antwort. Andererseits zeigte ein Patient, der unter Therapie initial Responder war, eine starke T-Zell-Antwort in beiden CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten bei schwacher Neutralisation. Vermutlich aufgrund der kleinen Gruppe aber auch in Übereinstimmung mit anderen Studien konnte in meiner Studie keine relevante Korrelation zwischen der Neutralisationsstärke und der T-Zell-Antwort bzw. keine Übereinstimmung der Ergebnisse im Verlauf der Infektion beobachtet werden. Die Ergebnisse meiner Studie haben gezeigt, dass Hepatitis C-Pseudopartikel (HCVpp) geeignete Antigene für die Untersuchung der Aktivität der neutralisierenden Antikörper und die spezifische Stimulation der T-Lymphozyten sind. Die Vorteile dieser Untersuchungsmethode sind ihre leichte Handhabung, die hohe biologische Sicherheit durch replikationsinkompetente und somit vermehrungsunfähige virale Partikel und der eindeutige und schnelle Nachweis durch die standardisierte Durchflusszytometrie. Mit dieser Methode kann eine Untersuchung der HCV-Infektion bzw. -Neutralisation auf reproduzierbare und einfache Weise erfolgen.
• Hepatitis C virus (HCV) is an enveloped RNA virus classified in the Flaviviridae family. HCV infection results in multiuspecific T-cell responses and neutralizing antibody production to various HCV envelope glycoproteins in nearly all immuncompetent patients. And yet they fail to clear the virus. Approximately 70% of individuals develope a chronic infection that may result in progressive liver disease. Because of the lack of a reliable in vitro or in vivo neutralizing assay little is known about the humoral immune response and the role of neutralizing antibodies in HCV infection. The development of a reliable virus system for studying the interactions between cells and the envelope glycoproteins of HCV has been a long-sought goal. In this study I investigated the humoral immune response in 31 chronically HCV-infected patients using hepatitis C pseudoparticles (HCVpp). The investigated collective considted in patients with different HCV genotypes without any treatment at the time of sampling and without HIV- or HBV-coinfection. The serum samples of 5 healthy probands provide the negative control. This study could demonstrate that the pseudotyped virus system was able to detect neutralizing antibodies in chronically infected patients. In contrast healthy probands didn’t show any neutralizing antibodies. In my experiments serum samples from patients infected with HCV genotypes different to the genotype of the HCVpp (genotype 1a) I used were able to reduce the infectivity of the HCVpp in nearly the same efficacy like samples from genotype 1a infected patients (crossreactive feature of neutralizing antibodies). In the last part of this study I compared simultaneous the results of antibody-dependent virus neutralization and CD4+ and CD8+ Tcell stimulation in 22 chronically infected patients. In my study 11 patients showed a highly, 9 patients a low and 2 patients not any HCV neutralization. These results were independently from the results in the T-cell stimulation assays and the HCV genotype. As well in absence of any T-cell response, neutralization could be observed. The investigated collective consisted mainly in patients chronically infected with HCV without any treatment at the time of sampling as well as in their history. The only two treated patients were nonresponder (HCV-PCR positive) and had a highly neutralization and strong CD8+ T-cell responses but lower or non CD4+ T-cell responses, respectively. The one patient who was an initial responder under therapy had a strong T-cell response in both CD4+ and CD8+ T-lymphocytes but lower neutralization activity. Assumedly because of the small group of tested patients but in concordance to other studies, I did not notice any relevant correlation between neutralization titers and T-cell response or any association of the experiments results with the infection course. In conclusion my study shows that HCVpp are appropriate antigens for the investigation of neutralizing antibody activity as well as for specific stimulation of T-lymphocytes. This assay benefits of its easy handling, the distinct detection by a standardizable flow cytometry-based method and the biologic safety of the replication-incompetent viral particles. With this method, a HCV infection and neutralization assay can be handled in a reproducible and accurate way.