Open Access

Qingyan Wu

• As one of the most widespread infectious diseases in the world, it is currently estimated that approximately 296 million people globally are chronically infected with Hepatitis B virus (HBV), the consequences of HBV infection cause more than 620,000 deaths each year. Although safe and effective HBV vaccines have reduced the incidence of new HBV infections in most countries, there are still around 1.5 million new infections each year. HBV remains a major health problem because there is no large-scale effective vaccination strategy in many countries with a high burden of disease, many people with chronic HBV infection are not receiving effective and timely treatment, and a complete cure for chronic infection is still far from being achieved. Since its discovery, HBV has been identified as an enveloped DNA virus with a diameter of 42 nm. For efficient egress from host cells, HBV is thought to acquire the viral envelope by budding into multivesicular bodies (MVBs) and escape from infected cells via the exosome release pathway. It is clear that HBV hijacks the host vesicle system to complete self-assembly and propagation by interacting with factors that mediate exosome formation. Consequently, the overlap with exosome biogenesis, using MVBs as the release platform, raises the possibility for the release of exosomal HBV particles. Currently, virus containing exosomal vesicles have been described for several viruses. In light of this, this study explored whether intact HBV-virions wrapped in exosomes are released by HBV-producing cells. First, this study established a robust method for efficient separation of exosomes from HBV virions by a combination of differential ultracentrifugation and iodixanol density gradient centrifugation. Fractionation of the density gradient revealed that two populations of infectious viral particles can be separated from the culture fluids of HBV-producing cells. The population present in the low-density peak co-migrates with the exosome markers. Whereas the population that appeared in the high-density fractions was the classical HBV virions, which are rcDNA-containing nucleocapsids encapsulated by the HBV envelope. Subsequently, the characterization of this low-density population was performed, namely the highly purified exosome fraction was systematically investigated. Relying on the detergent sensitivity of the exosome membrane and the outer envelope of the HBV virus, disruption of the exosome structure by treatment with limited detergent revealed the presence of HBsAg in the exosomes. At the same time, mild and limited NP-40 treatment of highly purified exosomes and a further combination of density gradient centrifugation resulted in the stepwise release of intact HBV virions and naked capsids from the exosomes generated by HBV-producing cells. This implies the presence of intact HBV particles encapsulated by the host membrane. The presence of exosome-encapsulated HBV particles was consequently also verified by suppressing the morphogenesis of MVBs or exosomes. Impairment of MVB- or exosome-generation with small molecule inhibitors has significantly inhibited the release of host membrane-encapsulated HBV particles as well. Likewise, silencing of exosome-related proteins caused a diminution of exosome output, which compromised the budding efficiency of wrapped HBV. Moreover, electron microscopy images of ultra-thin sections combined with immunogold staining visualized the hidden virus in the exosomal structure. Additionally, the presence of LHBs on the surface of exosomes derived from HBV-expressing cells was also observed. As expected, these exosomal membrane-wrapped HBV particles can spread productive infection in differentiated HepaRG cells. In HBV-susceptible cells, as LHBs on the membrane surface, this type of exosomal HBV appeared to be uptaken in an NTCP receptor-dependent manner. Taken together these data indicate that a fraction of intact HBV virions can be released as exosomes. This reveals a so far not described release pathway for HBV. Exosomes hijacked by HBV act as a transporter impacting the dissemination of the virus.
• Derzeit sind schätzungsweise 296 Millionen Menschen weltweit chronisch mit dem Hepatitis-B-Virus (HBV) infiziert und die Folgen einer HBV-Infektion führen jedes Jahr zu mehr als 620.000 Todesfällen, was sie zu einer der häufigsten Infektionskrankheiten der Welt macht. Obwohl sichere und wirksame HBV-Impfstoffe das Auftreten neuer HBV-Infektionen in den meisten Ländern verringert haben, gibt es immer noch etwa 1,5 Millionen Neuinfektionen pro Jahr. HBV stellt nach wie vor ein großes Gesundheitsproblem dar, da es in vielen Ländern mit hoher Prävalenz keine groß angelegte Impfstrategie gibt, viele Menschen mit chronischer HBV-Infektion nicht rechtzeitig und wirksam behandelt werden können und eine vollständige Heilung der chronischen Infektion noch lange nicht erreicht ist. Das Hepatitis-B-Virus (HBV) ist ein kleines, umhülltes DNA-Virus und gehört zur Familie der Hepadnaviridae. Die äußere Hülle, die die drei viralen Oberflächenproteine LHBs, MHBs und SHBs beinhaltet, umgibt das Nukleokapsid. Die Gesamtheit aller HBV-Oberflächenproteine wird als HBsAg bezeichnet. Das ikosaedrische Nukleokapsid wird durch das Kernprotein (HBcAg) gebildet und trägt das partielle doppelsträngige DNA-Genom von etwa 3,2 kb. Das HBV-Genom besteht aus 4 offenen Leserahmen, die für die virale Polymerase (P), das Kernantigen (HBcAg) oder seine sekretorische Variante e-Antigen (HBeAg), die Oberflächenproteine (HBsAg) und das regulatorische X-Protein (HBx) kodieren. Zusätzlich zu den infektiösen Viruspartikeln setzen HBV-produzierende Zellen nicht-infektiöse subvirale Partikel frei, die nur aus HBsAg bestehen und denen ein Genom und alle anderen HBV-Proteine fehlen. Es lassen sich zwei Formen unterscheiden: 22 nm große Sphären und lange Filamente. Während die Sphären hauptsächlich aus SHBs bestehen und nur geringe Mengen an LHBs und MHBs enthalten, zeichnen sich die Filamente durch einen höheren Gehalt an LHBs aus. Darüber hinaus werden nackte Kapside ohne Hülle freigesetzt. In den letzten 50 Jahren sind die grundlegenden Prinzipien des Lebenszyklus und der Morphogenese des Hepatitis-B-Virus (HBV) aufgeklärt worden. Diese bilden eine wichtige und wirksame Grundlage für aktuelle HBV-Behandlungen und die Entwicklung von Impfstoffen. Seit seiner Entdeckung wurde das HBV als ein umhülltes DNA-Virus mit einem Durchmesser von 42 nm identifiziert. Es wird immer deutlicher, dass die Freisetzung von HBV-Virionen und -Filamenten von der Maschinerie des endosomalen Sortierkomplexes (endosomal sorting complex required for transport, ESCRT) und den Wirtsmembran-Trafficking-Systemen abhängig ist. Für eine effiziente Freisetzung aus der Wirtszelle werden multivesikuläre Körper (multi vesicular bodies, MVBs) als Plattform für das Budding und den Austritt von HBV angenommen, wobei das reife Nukleokapsid von der Virushülle eingekapselt wird und dann über den exosomalen Freisetzungsweg aus den Zellen entweicht, wenn die MVBs mit der Plasmamembran verschmelzen. Es ist klar, dass HBV das vesikuläre System des Wirts nutzt, um seine Selbstorganisation und Verbreitung zu vervollständigen, indem es mit Faktoren interagiert, die die Exosomenbildung vermitteln. Die Überschneidung mit der Exosomenbiogenese, bei der MVBs als Freisetzungsplattformen verwendet werden, eröffnet somit die Möglichkeit der Freisetzung exosomaler HBV-Partikel. Zusätzlich zu den Viruspartikeln setzen Wirtszellen auch eine große Anzahl extrazellulärer Vesikel frei. Exosomen sind eine Unterart dieser Vesikel, die in Lipiddoppelschichten eingeschlossen sind und eine Größe von etwa 30 bis 150 nm aufweisen; sie teilen denselben Knospungsweg mit vielen Virionen. Insbesondere werden internalisierte Cargos in intraluminale Vesikel (ILVs) sortiert, die durch invertierte Knospung innerhalb eines intrazellulären Endosoms gebildet werden, was zum Auftreten von späten Endosomen führt und als MVBs bezeichnet wird. ILVs können abgebaut werden, während MVBs zu Lysosomen heranreifen. Alternativ könnten MVBs dann mit der Plasmamembran verschmelzen und ihre ILVs als Exosomen in die extrazelluläre Umgebung entlassen. Im Gegensatz zur Bildung von Mikrovesikeln (100-1000 nm) durch Abspaltung von Plasmamembranen werden Exosomen also durch Exozytose von mit ILVs versehenen MVBs gebildet. Es wurde nachgewiesen, dass Zellen vieler Spezies Exosomen in die extrazelluläre Umgebung freisetzen, und sie können auch in einer Vielzahl von Körperflüssigkeiten, einschließlich Plasma, Speichel und Urin, nachgewiesen werden...