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Ines Kühnel

• In the past decade, tissue-resident innate lymphoid cells (ILC) have become a central field of immunological research. ILC are a family of innate immune cells comprising cytotoxic Natural Killer (NK) cells and the non-cytotoxic helper like ILC1, ILC2 and ILC3. They mirror the functions and phenotypes of T cells, but do not require rearranged antigen-specific receptors for their rapid response to signals from injured or infected tissue. As potent cytokine producers being enriched in mucosal tissue, ILC play an essential role in tissue maintenance and regulating immunity to chronic inflammation and infection (Vivier et al., 2018). Although heterogeneity and plasticity of ILC complicates their classification, the pathophysiology of a broad variety of autoimmune and chronic inflammatory diseases have been associated with dysregulations in ILC subset distribution and functions (Dzopalic et al., 2019). This highlights their importance in human health and disease and accounts for the need for markers unambiguously describing the different ILC subtypes. This work introduces NKp65, a C-type lectin-like receptor (CTLR) encoded in the natural killer gene complex by the KLRF2 gene, as an exclusive marker for human ILC3. NKp65 expression especially discerns ILC3-like NK cell precursor from mature NK cells which express the NKp65-relative NKp80. Moreover, flow cytometric analysis of NKp65 expression aids in the demarcation of natural cytotoxicity receptor (NCR) expressing ILC3, from the closely related but functionally distinct RORt+ LTi cells and NCR- ILC3. This work further provides insights into NK cell development by in vitro differentiation studies in which NKp65 expressing cells are generated in presence of OP9 feeder cells and cytokines to support development. In such cultures, NKp65 expressing in vitro ILC (ivILC) acquire NKp80 expression in a Notch-dependent manner indicating their differentiation into mature NK cells. Acquisition of NK cell phenotypic markers is accompanied by NKp65 downregulation which leads to the mutually exclusive expression of NKp80 on NK cells and NKp65 on ILC3-like cells. Further insights are provided into the functional consequences of NKp65 engagement by its cognate high affinity ligand ‘keratinocyte-associated C-type lectin’ (KACL) which is selectively expressed on human keratinocytes (Bauer et al., 2015; Spreu et al., 2010). Expressed on ivILC, NKp65 mediates killing of KACL expressing target cells, suggesting that NKp65-KACL interaction promotes cellular cytotoxicity. In this context, the observed metalloproteinase dependent shedding of NKp65 might play a role in the termination of the cellular interaction. The findings on the regulation of NKp65 expression demonstrate the presence of a functional STAT5 response element in the KLRF2 promoter endowing a transcriptional control of NKp65 expression by IL-7 signaling. This provides an interesting link between the dependency of ILC3 on IL-7 signaling for their maintenance and the specific expression of NKp65 on these cells. In summary, this study provides new insights into the physiologic expression of the CTLR NKp65 on human ILC3. The dependency of NKp65 surface expression on sustained STAT5 signaling provided by IL-7 underlines the connection of NKp65 expression and an ILC3 phenotype which might contribute to promote future research in discerning the interspersed pathways of ILC3 and NK cell development. The tissue and cell specific expression of NKp65 on ILC3 and its ligand KACL on keratinocytes of the human skin further suggests an important role of this genetically coupled receptor-ligand pair in tissue specific immunosurveillance.
• Eine erstmalig vor circa zehn Jahren beschriebene Gruppe angeborener lymphoider Zellen (innate lymphoid cells, ILC) ist wichtiger Akteur des angeborenen Immunsystems und Gegenstand aktueller Forschung (Klose and Artis, 2020; Vivier et al., 2018). ILC spielen eine essenzielle Rolle bei der Abwehr von Pathogenen und in der Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase. Die Gruppe der ILC besteht aus den bereits intensiv erforschten zytotoxischen Natürlichen Killer (NK) Zellen sowie ILC1, ILC2 und ILC3. Aufgrund ihres Zytokinprofils und der Expression von für Differenzierung und Funktion relevanter Transkriptionsfaktoren (TF), werden ILC auch als die angeborenen Gegenspieler der T Zellen angesehen. NK Zellen entsprechen dabei den zytotoxischen CD8 T Zellen, während ILC1, ILC2 und ILC3 den CD4+ T Helfer-1 (Th1), Th2 und Th17 Zellen entsprechen (Diefenbach et al., 2014; Spits et al., 2013; Sun and Lanier, 2011). Im Gegensatz zu den adaptiven T Zellen, exprimieren ILC jedoch keine antigenspezifischen Rezeptoren. Weiterhin zirkulieren sie nicht kontinuierlich im Blutkreislauf, sondern werden als Gewebe-ständige (tissue resident) Zellen beschrieben. Ansässig im Gewebe, können ILC schnell auf Veränderungen der Umgebung reagieren und initiieren eine Immunantwort, die häufig mit der Sezernierung großer Mengen an Zytokinen einhergeht, lange bevor die adaptive Immunität einsetzt (Artis and Spits, 2015; Colonna, 2018; Mjosberg and Spits, 2016; Vivier et al., 2018). ILC weisen auch innerhalb ihrer Subklasse eine hohe Heterogenität auf. Die Zuweisung zu einer bestimmten Untergruppe ist daher meist nicht ausschließlich anhand eines Merkmals möglich, sondern erfolgt durch die gleichzeitige Analyse mehrerer Faktoren. Darunter zählen die Analyse des Zytokinprofils sowie die verschiedener, intrazellulär und oberflächenexprimierter Moleküle, so genannter „Marker“. Allen ILC ist gemein, dass sie keine charakteristischen Oberflächenmarker anderer hämatopoetischer Entwicklungslinien, so genannte lineage-Marker (lin) exprimieren. Darunter fallen die Marker von T Zellen (cluster of differentiation (CD) 3), B Zellen (CD19) und Monozyten (CD14) (Simoni and Newell, 2018). NK Zellen kennzeichnen sich zusätzlich typischerweise durch die Expression des TF Eomesodermin (EOMES) und der Oberflächenmarker CD56, CD94, CD16, NKp80 sowie den Natürlichen Zytotoxizitätsrezeptoren (natural cytotoxicity receptors, NCR) NKp30, NKp46 und NKp44 (Moretta et al., 2001; Vitale et al., 2001). NK Zellen vermitteln weiterhin Zytotoxizität und sezernieren Interferon gamma (IFN-y) als Antwort auf die Stimulation mit den Interleukinen (IL)-12 und IL-18 (Montaldo et al., 2016). Im Gegensatz zu den NK Zellen, exprimieren alle Helfer-ILC (ILC1, ILC2 und ILC3) den IL-7 Rezeptor (IL-7R). ILC1 werden weitestgehend durch die Expression des TF T-box expressed in T cells (T-bet) sowie das Fehlen spezifischer Marker der anderen Subklassen beschrieben und gelten als der nicht zytotoxische Gegenspieler der NK Zellen. Die Abgrenzung der ILC2 erfolgt hauptsächlich durch den TF GATA-3, die Expression des Prostaglandin D2 Rezeptors (chemotractant receptor homologuos molecule expressed on Th2 cells, CRTH2) und ihre Immunantwort auf die Stimulation mit IL 33 und IL-25 in Form von Sezernierung der Zytokine IL-5, IL-13 and IL-9. Zellen der Gruppe der RAR-related orphan receptor gamma-t (RORyt) exprimierenden ILC3 reagieren auf die Stimulation mit IL-1ß und IL-23 mit der Sekretion von IL-17 und IL 22 (Montaldo et al., 2016). Innerhalb der Gruppe der ILC3 wird weiterhin zwischen den „Lymphoid-Tissue-inducer“ (LTi) Zellen und den NCR+ oder NCR- ILC3 unterschieden. Die Subklasse der NCR-/NCR+ ILC3 zeichnet sich dabei vor allem durch die Expression des Oberflächenmarkers CD117 aus, wohingegen LTi Zellen meist durch die zusätzliche Expression des C-C-Chemokin Rezeptors 6 (CCR6) charakterisiert werden (Melo-Gonzalez and Hepworth, 2017). Obwohl ILC durch die beschriebenen Marker formal in die einzelnen Subklassen unterteilt werden können, wird ihre Klassifizierung durch die hohe Heterogenität auch innerhalb der einzelnen Untergruppen erschwert. Zusätzlich haben ILC keinen starren Phänotyp, sondern weisen sich durch die Eigenschaft der sogenannten Plastizität aus. Diese beschreibt einen Vorgang, bei dem ILC durch bestimmte Umwelteinflüsse den Phänotyp bezüglich der Zytokinproduktion und funktionelle Eigenschaften einer anderen Untergruppe annehmen (Bal et al., 2020). Trotzdem wurde in einigen Studien ein Zusammenhang zwischen unterschiedlichen Autoimmun- und chronischen Entzündungs-Krankheiten und einer Veränderung der Verteilung und Funktion der ILC Untergruppen hergestellt (Dzopalic et al., 2019). Für die weitere Forschung auf diesem Gebiet sind Marker, durch deren alleinige Analyse eine spezifische Charakterisierung der Zellen erfolgen kann, ein essenzielles Hilfsmittel. Bisher sind solche Marker jedoch kaum bekannt. Die Etablierung solcher Marker würde nicht nur zur einfacheren Detektion der ILC beitragen, sondern könnte auch die Erforschung ihrer Entstehung erleichtern. ...