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Dimitrios George Papasotiriou

• Proteomic analysis is the large-scale identification and characterization of proteins including post translational modifications. Proteomics encompasses a number of approaches including bottom-up and top-down workflows which are widely used independently and complementary as tools for the successful study of protein species. However, up to the present day these techniques have not been able to overcome every analytical limitation. Mass spectrometry has played a vital role alongside proteomics in providing the required analytical means of detecting protein amounts down to the atomole range. Soft ionization methods such as matrix assisted laser desorption/ionization (MALDI) and electrospray ionization (ESI) have permitted the transfer of peptides and intact proteins into the gas phase without extensive degradation. The introduction of recent developments in MALDI technology such as the highly sensitive 4-chloro-alpha-cyanocinnamic acid matrix (Cl-CCA) as well as the commercial availability of a MALDI-LTQ-Orbitrap which boosts peptide mass accuracy below 3 parts per million (ppm), have offered new prospective in protein analysis. The aim of the current study is to incorporate these new aspects and provide further advancements in gel-based as well as gel-free proteomic workflows. Peptides of proteolytically digested proteins are routinely analyzed by means of peptide mass fingerprinting (PMF) often combined with MS/MS analyses to complement and substantiate PMF results by peptide sequence information. The most widely used protease for enzymatic digestion is trypsin, since it exhibits a very specific cleavage behavior limited to C-terminal hydrolyses after basic amino acids. However, less specific enzymes such as chymotrypsin, elastase and pepsin have emerged as useful tools in the analysis of particular protein classes e.g. membrane, cereal, and phosphorylated proteins. In this work a comprehensive bottom-up proteomic investigation including in-solution and in-gel protein digestions of analytes covering small to large, acidic to basic, and hydrophobic to hydrophilic proteins in combination with a series of less specific enzymes are presented in order to show the superiority of the novel MALDI matrix Cl-CCA. The Cl-CCA matrix proved to be highly superior compared to standard α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) since an average detection of more than 2- to 3-fold peptide amount was possible depending on the used protease and, therefore, resulting in strongly increased sequence coverage. Additionally, protein identification of chymotrypsin and elastase in-gel digested protein standards was evaluated. The MALDI-LTQ-Orbitrap providing peptide mass accuracy below and up to 3 ppm in combination with Cl-CCA as matrix and newly optimized digestion conditions led to unambiguous protein identifications of all chymotryptic digests outperforming its tryptic counterparts in the case of hydrophobic bacteriorhodopsin and α-globin from hemoglobin A (α-HgbA). In addition, significantly higher sequence coverage and increased number of detected peptides was acquired. Moreover, a proposed workaround for elastase digestions was capable of providing a solution for successful identification results. Apart from digestions of singly separated proteins, solution isoelectic focusing (sIEF) was evaluated. OFFGEL fractionation is an efficient means of fractionating peptides and proteins according to their isoelectric point (pI) values through immobilized pH gel (IPG) strips after which samples are recovered in solution. Consequently, an issue of peptide recovery arises as a category of peptides relatively insoluble to the recovery solution should be present. A method was developed including the scraping of gel matrix from the IPG strips and peptide extraction using acetonitrile as organic solvent in combination with analytical techniques such as nLC-MALDI-MS/MS for peptide identification. The nature of the peptide species remaining in-gel was analysed and attributed to peptide solubility. A general trend in which a high percentage of neutral and hydrophobic peptides remaining entrapped in the IPG gel strip was observed. The present work also examines a new top-down proteomic workflow involving protein elution from cleavable gels containing the labile crosslinker ethylene-glycol-diacrylate (EDA). Protein amounts of as low as 100 ng loaded onto EDA gels were detected using MALDI-TOF MS in the linear acquisition mode. Proteins from 8.5 up to 78 kDa were successfully measured including a hydrophobic 15 kDa core protein attaining a GRAVY score of +0.079. Additionally, the method was compatible with one dimensional protein separation as well as for 2-D IEF/SDS-PAGE. Lastly, two methods for protein identification were tested and found to be compatible to the proposed technique.
• Die Analyse des Proteoms umfasst die breit angelegte Massenidentifizierung und Charakterisierung von Proteinen inklusive ihren posttranslationalen Modifikationen mit Hilfe einer Vielzahl an Methoden, darunter die häufig verwendeten bottom-up und top-down Verfahren, welche unabhängig und komplementär für die erfolgreiche Analyse von Proteinen eingesetzt werden. Bis heute haben es die erzielten Fortschritte jedoch nur ansatzweise ermöglicht, die bestehenden Limitierungen zu bewältigen. Dabei hat die Massenspektrometrie durch die Bereitstellung der notwendigen analytischen Mittel zur Detektion von Proteinmengen bis in den attomolaren Bereich eine entscheidende Rolle für die Proteomanalyse gespielt. Die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI) und Elektrospray-Ionisation haben es als „sanfte“ Ionisationsmethoden ermöglicht, Peptide und intakte Proteine ohne extensive Degradierung in die Gasphase zu überführen. Die Einbindung aktueller Entwicklungen in die MALDI-Technologie, wie beispielsweise die hoch sensitive Matrix 4-Chlor-?-cyanzimtsäure (Cl-CCA) sowie die kommerziell erhältliche MALDI-LTQ-Orbitrap, welche eine Massengenauigkeit unter 3 parts per million ermöglicht, eröffneten neue Perspektiven für eine noch aussagekräftigere Proteinanalyse. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, diese neuen Aspekte in Gel-basierten und Gel-freien Methoden zur Proteomanalyse einzubinden und weiterzuentwickeln. Peptide von proteolytisch verdauten Proteinen werden routinemäßig mittels Peptide Mass Fingerprint (PMF) analysiert. Um PMF-Ergebnisse mit den entsprechenden Peptidsequenzen zu ergänzen und zu untermauern, wird PMF häufig mit MS/MS-Analysen kombiniert. Die am häufigsten benutzte Protease für enzymatische Spaltungen ist Trypsin, da sie sehr spezifisch C-terminale Spaltungen nach basischen Aminosäuren ermöglicht. Nichtsdestoweniger haben sich auch weniger spezifische Enzyme wie Chymotrypsin, Elastase oder Pepsin als nützliche Werkzeuge für die Analyse bestimmter Proteinklassen, wie beispielsweise Membran-, Cereal- und phosphorylierte Proteine, herausgestellt. In dieser Arbeit wird eine umfassende Untersuchung proteolytischer Prozesse nach dem bottom-up Ansatz vorgestellt, welche sowohl lösungs- als auch gelbasierte Verdaus von Analyten beinhaltet. Die hierfür verwendeten Analyte reichen von großen bis kleinen, sauren bis basischen und hydrophoben bis hydrophilen Proteinen und werden kombiniert mit einer Reihe von spezifischen und weniger spezifischen Enzymen, um die Überlegenheit der neuen MALDI-Matrix Cl-CCA zu demonstrieren. Cl-CCA erwies sich gegenüber der Standardmatrix ?-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) als deutlich überlegen, weil es in Abhängigkeit der benutzten Protease möglich war, durchschnittlich mehr als die 2-3fache Anzahl an Peptiden zu detektieren, was zu einer stark erhöhten Sequenzabdeckung führte. Desweiteren wurden Protein-Identifikationen von mit Chymotrypsin und Elastase in-Gel verdauten Standardproteinen durchgeführt. Die hohe Massengenauigkeit der MALDI-LTQ-Orbitrap in Kombination mit der Matrix Cl-CCA sowie optimierten Verdaubedingungen führte zu signifikanten Proteinidentifikationen aller chymotryptisch verdauten Proteine, welche im Falle des hydrophoben Bacteriorhodopsins und des a-Globins von Hämoglobin A die Ergebnisse der entsprechenden Trypsin-Verdaus deutlich übertrafen. Darüber hinaus wurden für chymotryptisch verdaute Proteine unter Verwendung von Cl-CCA signifikant höhere Sequenzabdeckungen und eine größere Anzahl von detektierten Peptiden als bei Verwendung von CHCA erhalten. Außerdem wurde ein Ansatz für erfolgreiche Identifizierungen von mit Elastase verdauten Proteinen erarbeitet. Zusätzlich zu den Verdaus einzeln separierter Proteine wurde die isoelektrische Fokussierung (IEF) von Peptiden evaluiert. Die OFFGEL-Fraktionierung stellt ein effizientes Mittel zur Peptid- und Proteinfraktionierung nach deren isoelektrischen Punkten durch immobilisierte pH-Gelstreifen (IPG) dar, woraufhin die Fraktionen am Ende der Trennung in Lösung erhalten werden. Daher stellt sich die Frage nach der Peptidausbeute und insbesondere nach dem verbleibenden Anteil von in dem eingesetzten Puffer schwer löslichen Peptiden. Es wurde eine Methode entwickelt, bei der durch das Abkratzen der Gelmatrix von den IPG- Streifen mit nachfolgender Extraktion der unlöslichen Peptide mit Acetonitril, sowie analytischen Trenntechniken wie der nLC-MALDI-MS/MS für die löslichen Fraktionen, Peptide erleichtert identifiziert werden können. Die physikochemischen Eigenschaften der bei in-Gel-Verdaus im Gel verbleibenden Peptide wurden charakterisiert und mit der Peptid-Löslichkeit korreliert. Als genereller Trend konnte festgestellt werden, dass ein hoher Prozentsatz an neutralen und hydrophoben Peptiden in den IPG-Streifen verbleibt. Die vorliegende Arbeit untersucht abschließend einen neuen top-down Proteom-Ansatz zur Elution von Proteinen aus spaltbaren Gelen mit dem labilen Quervernetzer Ethylenglykoldiacrylat (EDA). Mittels MALDI-TOF MS konnten im linearen Modus mit EDA-Gelen aufgetrennte Proteinmengen herab bis zu 100 ng detektiert werden. Proteine von 8,5 bis 78 kDa inklusive einem hydrophoben 15 kDa Protein mit einem GRAVY-Score von +0,079 konnten erfolgreich nachgewiesen werden. Zusätzlich war diese Methode mit der eindimensionalen Proteintrennung und der 2D-Gelelektrophorese (2D-IEF/SDS-PAGE) kombinierbar.