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Shravan Kumar Mishra

• The heat stress (hs) response is universal to all organisms. As the cell senses increase in temperature, heat stress transcription factors (Hsfs) are activated to upregulate the expression of a number of genes encoding heat stress proteins (Hsp) which act as molecular chaperones to protect cells against heat damages. In higher plants, the phenomenon seems to be unusually complex both at the level of Hsfs and Hsps (e.g., 21 Hsf encoding genes in Arabidopsis and at least 17 in tomato). Upon prolonged hs, another characteristic property of plant cells is the assembly of large cytosolic aggregates called heat stress granules (HSG), which are composed of Hsps, HsfA2, RNA and RNA-binding proteins. The present work was aimed to understand plant hs response using tomato as a model system. To study the function of tomato Hsfs in their native system, we generated transgenic tomato lines altered in expression of HsfA1, HsfA2, and HsfB1. Tomato plants with 10-fold overexpression of HsfA1 (OE plants) were characterised by integration of a single HsfA1 expression cassette, whereas the plants harbouring a tandem inverted repeat (IR) of the cassette showed cosuppression of HsfA1 (CS plants). The lack of HsfA1 expression in CS plants results from posttranscriptional gene silencing connected with the formation of small interfering RNA (siRNA). Under normal growth conditions, major developmental features were similar for wild-type (WT), OE and CS plants. However, in contrast to the former two, CS plants and fruits were extremely sensitive to elevated temperature because hs-induced synthesis of major chaperones and Hsfs was strongly reduced or lacking. Despite the complexity of the plant Hsf family, the function of tomato HsfA1 is unique as master regulator of induced thermotolerance. On the other hand, maintenance of essential chaperones in CS plants during seed development suggests involvement of other Hsfs and/or transcription factor(s). HsfB1 and HsfA2 transgenic tomato plants, unaffected in thermotolerance, further supported the function of HsfA1 as the major factor regulating hs-inducible genes. Hs87 independent phenotypes of plants with altered expression of HsfB1 indicates developmental role of this Hsf. Using transient reporter assays with mesophyll protoplasts from WT tomato, we demonstrated that plasmids encoding Hsfs A1, A2 and A3 were well expressed which could function as activators for reporter gene expression. However, in protoplasts derived from CS plants, plasmids encoding HsfA2 and HsfA3 were normally expressed but even higher amounts of HsfA1 expression plasmids were completely silenced. Therefore, silencing of HsfA1 in CS plants was also reproduced in its mesophyll protoplasts. Lacking thermotolerance in CS protoplasts could be restored after transformation with expression plasmids encoding functionally equivalent HsfA2 or HsfA3 resulting in (i) expression of chaperones, (ii) survival of the cells at otherwise lethal temperature, (iii) thermoprotection of firefly luciferase, and (iv) assembly of heat stress granules (HSGs). The strong silencing caused by an IR in CS plants opened the possibility of a broad use of RNAi for gene knock-down also in the transient system of mesophyll protoplasts. Using this technology, we attempted to dissect essential components of thermotolerance and HSG assembly. We demonstrated the previously reported function of chaperones such as Hsp70 and Hsp101, and could discriminate the in vivo chaperone functions of different isoforms of Hsp20 and Hsp70 proteins. Hsp17-CI, Hsp70 (hs-inducible isoforms), and Hsp101 are absolutely essential chaperones for thermotolerance in plants. Furthermore, the results also show that despite Hsp17-CI and -CII being major components of HSG complexes, they are dispensable for assembly of these complexes. Based on these results, it is proposed that in the transient protoplast system an approach with gene-specific IRs can be used to discriminate functions of closely related isoforms among protein-families and to dissect complex protein networks.
• Aufgrund der sessilen Lebensform sind Pflanzen in besonderer Weise den ständig wechselnden Umweltbedingungen ausgesetzt. Das erfordert ein ungewöhnliches Mass an Anpassungsfähigkeit, damit Überleben und Entwicklungsfähigkeit mit Blüten-, Frucht- und Samenbildung auch unter diesen Umständen gewährleistet sind. Im Vergleich mit anderen Organismen, ist ein auffälliges Merkmal von Pflanzen die Komplexität der Stressantwortsysteme. Das gilt in besonderer Weise für die Vielfalt von Chaperonen und regulatorischen Proteinen (Hitzestresstranscriptionsfaktoren, Hsf), die die Antwort auf erhöhte Temperaturen (Hitzestressantwort) kennzeichnt. Die jüngsten Erfolge der Genomanalyse bei Arabidopsis und Reis sowie die Verfügbarkeit von umfangreichen internationalen Datenbanken mit sogenannten expressed sequence tags (ESTs) haben ergeben, dass insgesamt mehr als 20 Hsfs, die in drei unterschiedlichen Strukturklassen eingeteilt werden können, in irgend einer Weise an der Regulation der Hitzestressantwort bei Pflanzen beteiligt sind. Ziel der Arbeit war die Untersuchung von Tomatenmutanten mit veränderten Expressionsmustern von Chaperonen und Hitzestresstranscriptionsfaktoren, um Einblicke in die funktionelle Diversifizierung der beteiligten Komponenten zu erhalten. Ausgangspunkt waren Tomatenpflanzen mit Insertionen von Sense- und Antisense- Kassetten für HsfA1, HsfA2 und HsfB1. Entscheidend für die Entwicklung der experimentellen Arbeiten war zunächst eine einzige primär transgene T0 Pflanze mit mehreren Insertionen der Sense Kassette von HsfA1, die im Verlauf unserer weiteren Züchtungsarbeiten in mehrere Linien aufspaltete. Eine Linie mit einer einzigen Transgenkassette hatte eine etwa 10-fach erhöhte Expression von HsfA1 (overexpression line OE). Zwei weitere Linien waren gekennzeichnet durch eine Tandem Integration von 2 Transgenkassetten mit invertierter Anordnung (IR). Dieses führt zu Cosuppressionseffekten (CS2 und CS3 Linien), d.h. nicht nur die Expression des Transgens sondern auch die des Endogens von HsfA1 wird unterbunden. Die Zahl der eingebauten Kassetten im Genom und ihre Anordnung wurden mit Hilfe von Southern Blots und PCR Analysen aufgeklärt. Nach der Aufspaltung und Selektion der homozygoten Linien waren die Erbeigenschaften und Phänotypen der drei erhaltenen Linien (OE, CS2, CS3) über viele Generationen stabil. Der molekulare Mechanismus der Cosuppression konnte in unserem Fall eindeutig auf die Bildung von sogenannter „interference RNA“ (RNAi) zurückgeführt werden. Die Anordnung der beiden Transgenkassetten als inverted repeat (IR) führt zur Synthese von mRNA Molekülen mit Informationen vom Sense- und Antisensestrang des HsfA1 Gens. Die daraus resultierende Bildung von RNA-Haarnadelstrukturen wird in den Zellen von einem Endonukleasekomplex als abartig erkannt (DICER Komplex) und in kurze Doppelstrang RNA Fragmente von etwa 21 Nukleotiden zerlegt. Diese dienen als Führungs-RNA (guide RNA) für einen weiteren RNAse Komplex (RISC Komplex), der die selektive Zerstörung der HsfA1 mRNA bewirkt. Der ganze Prozess wird als posttranscriptional gene silencing (PTGS) bezeichnet. Durch Auftrennung der Fraktion kleiner RNAs aus Tomatengewebe und entsprechende Hybridisierung konnten wir die Existenz dieser RNAi Moleküle in den CS Pflanzen nicht aber in WT und OE Pflanzen nachweisen. Überraschend waren die tiefgreifenden Auswirkungen der veränderten Expression von HsfA1 in den transgenen Pflanzen. Im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen war in den HsfA1 Überexpressionslinien (OE) die Expression der Hitzestress-induzierten Gene stark gesteigert und fand in einigen Geweben auch unabhängig von einer Stressinduktion statt. Im Gegensatz dazu fehlten praktisch alle Hitzestress-induzierten Proteine in den Cosuppresionsslinien (CS). Das war deshalb überraschend, weil wir angenommen hatten, dass der Expressions Knock-out eines der 20 Hsfs durch die Aktivität verwandter Hsfs ausgeglichen werden könnte. Das ist offensichtlich nicht der Fall. HsfA1 ist der Master-Regulator der Hitzestressantwort in Tomate. Bei Versuchen mit Tomatenpflanzen im Gewächshaus unter den erhöhten Stressbedingungen des Sommers 2003 oder aber auch in Klimakammern mit erhöhten Temperaturen konnte man die drastischen Folgen des Ausfalls von HsfA1 direkt beobachten. Die Pflanzen im vegetativen Zustand waren gegenüber dem Wildtyp extrem Temperatur-empfindlich, und die Fruchtreifung kam vollständig zum Erliegen. Auf der anderen Seite haben wir keinerlei Unterschiede in Wachstum und Entwicklung (Blütenansatz, Fruchtreifung, Samenkeimung etc.) zwischen den drei Linien beobachtet, wenn sie bei 25°C gehalten wurden. Auch die entwicklungs-spezifische Expression von Chaperonen bei der Samenreifung war unverändert. Offensichtlich spielt HsfA1 dabei keine nennenswerte Rolle. Es wird sogar während der Samenreifung selektiv abgebaut und wird erst in der frühesten Phase der Samenkeimung wieder nachweisbar. Dieser interessante Vorgang liess sich sehr klar am Beispiel der OE Pflanzen belegen. Zur experimentellen Verifizierung der an ganzen Pflanzen beobachteten Effekte wurde ein transientes Genexpressionssystem mit Mesophyllprotoplasten aus steril angezogenen Tomatenpflanzen der drei Linien (WT, OE, CS3) neu etabliert. Entsprechend unseren langjährigen Erfahrungen mit Tabakmesophyllprotoplasten, lassen sich auch die Tomatenprotoplasten relativ einfach in Gegenwart von Polyethylenglykol transformieren und zu Reporterassays und in situ Chaperonassays nutzen. Die Ergebnisse mit Protoplasten aus den CS3 Pflanzen sind besonders aufschlussreich. Die durch den Ausfall von HsfA1 fehlende Kapazität zur Expression von Hitzestressinduzierten Genen und damit zur Ausbildung von Themotoleranz kann durch Tranformation mit verschiedenen, nahe verwandten Hsfs repariert werden (HsfA2, HsfA3, HsfA4b). Diese durch entsprechende Expressionsplasmide eingebrachten Hsfs sind also funktionell äquivalent zu HsfA1 und können ihn sogar in der Stärke der Genexpression übertreffen, aber sie stehen in den ganzen Pflanzen nicht zur Verfügung. Warum das so ist, konnten wir nur für HsfA2 eindeutig klären. Dieser ist ein strikt Hitzestress-induziertes Protein und daher in seiner Expression ebenfalls von HsfA1 als Masterregulator abhängig. Im Rahmen meiner Untersuchungen habe ich auch andere transgene Tomaten-Linien einbezogen, in denen die Expression von HsfA2 und HsfB1 durch Antisense Konstrukte ausgeschaltet waren, und eine Linie mit Überexpression von HsfB1. Unabhängig von den Testbedingungen (Kontrolle oder Hitzestress) waren die Phänotypen bei weitem nicht so deutlich wie bei den Linien mit geänderter Expression von HsfA1. Dennoch sind zwei Beobachtungen sehr aufschlussreich für die Beurteilung der besonderen Rolle von HsfB1 für die Entwicklung der Pflanzen. Die konstitutive Expression von HsfB1 in den HsfB1 Sense Pflanzen führt zu einem gedrungenen Wachstum und vorzeitigem Fruchtansatz, während das Fehlen von HsfB1 in den Antisensepflanzen zwar keinen sichtbaren Effekt auf die Themotoleranz hat, aber zu einem vorzeitigen Altern und Absterben der Pflanzen führt. Die erfolgreichen Arbeiten zur Charakterisierung der HsfA1 CS Linien und der Wiederherstellung der Thermotoleranz in entsprechenden Mesophyllprotoplasten hat einen neuen para-genetischen Zugang zur Analyse der komplexen Proteinnetzwerke ermöglicht, die an dem Phänomen der Thermotoleranz beteiligt sind. Dafür wurden im Grundansatz Mesophyllprotoplasten mit Plasmiden transformiert, die für HsfA2 und/oder HsfA3 kodierten und ein Plasmid, das für Luciferase aus Photinus pyralis (Glühwürmchen) als thermosensitivem, leicht nachweisbarem Reporterprotein kodiert. Wir konnten in diesem Messansatz in den Protoplasten den Schutz der Luciferase gegen thermische Denaturierung bei 41°C (30 Minuten) und die nachfolgende Renaturierung für 120 Minuten bei 25°C als Wirkung des zelleigenen Chaperonsystems analysieren. Mit Hilfe von genspezifischen IR-Konstrukten haben wir aber auch die Bildung der entsprechenden RNAi in dem transienten Reporterassay benutzt, um die Bildung einzelner Komponenten des Chaperonsystems zu verhindern und damit ihre Rolle für Proteinfaltung und Proteintopogenese in einem transienten Expressionssystems zu untersuchen.