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Ulrich Kuch

• Shaped by some of the most dramatic tectonic events of the Cenozoic, the parts of southern and eastern Asia that have become known as the Oriental faunal region comprise vast areas of great geological complexity and ecological diversity. One of the four major groups of terrestrial elapid snakes in this region is the genus Bungarus. These nocturnal and predominantly ophiophagous snakes are widely known as kraits and are an important cause of snakebite mortality throughout their wide range that extends from Afghanistan to Vietnam and eastern China, and south to the Indonesian islands of Java and Bali. Although present on Borneo, kraits have not been found on any island of the Philippines, nor on Lesser Sunda Islands east of Bali. Despite their medical significance and the great importance of Bungarus toxins as tools in neuropharmacology, krait systematics and taxonomy have remained largely unstudied. Twelve species of Bungarus were recognized at the beginning of the present study. Many of these are rare in collections, and most aspects of their biology are unknown. While some species are highly distinct, most kraits are conservative morphologically, rendering molecular methods invaluable for the study of their diversity and biogeography. This study is the first to address the relationships within Bungarus and the historical biogeography of kraits based on molecular evidence. I inferred phylogeographic relationships based on analyses of new nucleotide sequences of the entire mitochondrial cytochrome b gene of 51 kraits and partial NADH dehydrogenase subunit 4 sequences of 40 kraits which I analyzed together with a representative sample of 32 published elapid and non-elapid outgroup taxa using Bayesian, maximum-likelihood, maximum-parsimony and neighbor-joining methods. I then used the recovered phylogeny to investigate the evolution of selected morphological characters and, together with collections-based geographical distribution information, in dispersal-vicariance analyses with models of variable taxonomic and biogeographic complexity. The phylogenetic analyses demonstrate that the current taxonomy of kraits does not adequately represent either the relationships or the genetic diversity in this genus. In contrast, I identified monophyletic groups that are congruent with recognized biogeographic units as well as extensive ecomorph evolution and morphologically cryptic speciation. The following additional conclusions are collectively supported by the mitochondrial phylogeny and morphological as well as biochemical synapomorphies: (1) Kraits are monophyletic with respect to the remaining taxa of the Elapidae; (2) Bungarus flaviceps and Bungarus bungaroides form the monophyletic sister clade of a clade formed by B. fasciatus, black-and-white-banded, and uniformly black taxa; (3) the remaining taxa are divisible into two sister clades, the South Asian species (Bungarus sindanus (Bungarus caeruleus, Bungarus ceylonicus)) vs. Himalayan, Burmese, Southeast and East Asian taxa; (4) within the latter, Burmese taxa form the sister clade to Southeast and East Asian taxa; (5) the widespread and medically significant species Bungarus candidus and Bungarus multicinctus are paraphyletic. The results of this study highlight the importance of vicariant geological events and sea level fluctuations for the cladogenesis of kraits. Events of particular importance in the evolution of kraits include the uplift of the Indo-Burman ranges (Arakan-Naga Hills) which separated black-and-white banded kraits in India and Southeast Asia, and the uplift of mountain ranges in Yunnan, China (e.g., the Gaoligong Shan), which coincided with lineage separation in two distantly related clades of kraits. Alternating dispersal and vicariance events due to Pleistocene climatic and sea level changes have caused complex phylogeographic patterns in kraits in Southeast Asia. Zones of contact between closely related evolutionary lineages of the B. candidus complex are identified in Thailand, Vietnam, and southern China (Hainan). Within this complex, two main clades are revealed. One includes populations from the Southeast Asian mainland and is in contact with B. multicinctus in southern China. The other consists of populations from Thailand, southern Vietnam, Java, and Bali. The phylogeny as well as genetic distances suggest a scenario in which a Pleistocene southward dispersal of B. candidus to Sumatra, Java, and Bali during times of low sea levels was temporarily interrupted by vicariant events (rising sea levels, especially flooding of the Malacca Strait between Sumatra and the Malay Peninsula, and of the Bali Strait between Java and Bali). In this context, the close phylogenetic relationship between haplotypes from southern Vietnam and those from Java and Bali suggests that "southern" B. candidus dispersed directly via colonization of the widely receded South Chinese Sea, and not by taking a detour via the Malay Peninsula and Thailand, which were already inhabited by other populations of B. candidus. Using these phylogenetic estimates as the framework for a study on the diversity and evolution of krait venom components, I applied biochemical and molecular genetic approaches to identify and quantify polypeptide and protein toxins in krait venom, focusing on the distribution and molecular evolution of alpha-bungarotoxin, an irreversible competitive antagonist of nicotinic acetylcholine receptors with an exceptionally high applied significance as a receptor probe. I was specifically interested in the medically relevant question of intraspecific and interspecific variability in toxin diversity, and whether receptor-binding postsynaptic toxins evolve at rates different from those of presynaptic neurotoxins like beta-bungarotoxin, which act by destroying the nerve terminal and are believed to exhibit hypervariable functional diversification due to an accelerated mode of molecular evolution. In the context of this question, I isolated and purified the major lethal neurotoxins from B. candidus venoms by sequential steps of liquid chromatography for structural and functional characterization studies. Cloning and sequence analysis of toxin-coding genomic DNAs showed that the gene encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, originally isolated from B. multicinctus venom, is widely present and highly conserved in multiple populations of B. candidus and is expressed as the principal postsynaptic neurotoxin at least in Javan B. candidus. In addition to the widespread presence of genomic DNAs encoding the alpha-bungarotoxin alanine-31 variant, the present study also revealed the partial genes of three novel alpha-bungarotoxin isoforms in addition to the previously known alanine-31 and valine-31 variants, all of which share an invariant exon 3 coding region. While alpha-bungarotoxin is the principal postsynaptic neurotoxin of Taiwanese B. multicinctus and Javan B. candidus, the main postsynaptic neurotoxin of Thai B. candidus both by quantity and lethality was a novel polypeptide of similar toxicity with a mass of 8030 Da and 73 amino acid residues, whose characterization at the genetic and protein levels revealed a novel subgroup of krait neurotoxins, here named alpha-delta-bungarotoxins and represented by four sequences from Bungarus caeruleus and B. candidus. alpha-delta-Bungarotoxins share high sequence homology with alpha-bungarotoxins but the purified, 8030 Da alpha-delta-bungarotoxin-1 exhibits only reversible, low affinity binding to nicotinic receptors and high site-selectivity for the acetylcholine binding site at the alpha-delta-subunit interface of the receptor. These properties render alpha-delta-bungarotoxin not only the first snake long-chain neurotoxin with reversible binding and binding-site selectivity, but also an exciting natural tool with which to address structure-function relationships at the subunit interfaces of the human receptor. The results of comparisons of the number of non-synonymous nucleotide substitutions per nonsynonymous site (dN) to the number of synonymous nucleotide substitutions per synonymous site (dS) strongly suggest that positive selection is acting on exon 2 of the alpha-bungarotoxin and probably also of the alpha-delta-bungarotoxin genes. In addition, the numbers of nucleotide substitutions per site of intron (dI) compared to the dS value of the toxin-coding exon regions provide strong evidence for accelerated molecular evolution in exon 2 of alpha-delta-bungarotoxins —whose value of dI is only one-eighth of the value of dS—whereas the hypothesis of accelerated evolution is rejected for 13 unique genomic DNAs encoding five alpha-bungarotoxin isoforms from B. candidus and B. multicinctus....
• Geformt durch einige der dramatischsten tektonischen Ereignisse des Känozoikums, umfasst die Orientalische Faunenregion riesige Gebiete größter geologischer Komplexität und ökologischer Diversität. Eine der vier Hauptgruppen terrestrischer Giftnattern (Elapidae) und eine wichtige Ursache tödlicher Schlangenbissvergiftungen in dieser Region sind Kraits (Bungarus). In der vorliegenden Arbeit wurde die Phylogenie der Kraits erstmals mittels DNA-Sequenzanalysen untersucht und mit vier Methoden der phylogenetischen Inferenz analysiert. Die resultierende Phylogenie wurde zur Aufklärung der Evolution morphologischer Merkmale und in Ausbreitungs-Vikarianz-Analysen eingesetzt. Die methodenübergreifend weitgehend kongruenten Ergebnisse zeigen, dass die gegenwärtige Taxonomie der Kraits weder deren Phylogenie noch ihre genetische Diversität adäquat widerspiegelt. Im Gegenteil werden monophyletische Gruppen identifiziert, die kongruent mit bekannten biogeographischen Einheiten sind, außerdem weit verbreitete Konvergenz in Färbungsmerkmalen im Sinne einer Ökomorphen-Evolution und multiple, morphologisch kryptische Artbildung. Die Ergebnisse stellen die entscheidende Bedeutung heraus, welche vikariante geologische Ereignisse für die Kladogenese von Kraits hatten. Ereignisse von besonderer Wichtigkeit waren hierbei im Mio-Pliozän die Entstehung der Indio-birmanischen Gebirgskette und das Aufrichten der Gebirge von Yunnan im Südwesten Chinas. Im Pleistozän führten alternierende Ausbreitungs- und Vikarianzereignisse infolge globaler klimatischer Fluktuationen und wechselnder Meeresspiegel zu komplexen phylogeographischen Mustern bei den Kraits Südostasiens. In Untersuchungen zur Diversität und Evolution von Krait-Giften wurden die hauptsächlichen letalen Neurotoxine aus Bungarus-candidus-Giften isoliert, aufgereinigt und charakterisiert. Analysen toxincodierender DNA-Sequenzen zeigten, dass das Gen für das ursprünglich aus dem Gift des Taiwanesischen Vielbindenkraits (Bungarus multicinctus) isolierte alpha-Bungarotoxin auch bei javanischen B. candidus vorkommt, hochgradig konserviert ist und als das hauptsächliche postsynaptisch angreifende Neurotoxin dieses Giftes exprimiert wird. Das wichtigste postsynaptische Neurotoxin thailändischer B. candidus ist dagegen ein neues Polypeptid von 73 Aminosäureresten und einer experimentellen Masse von 8031 Da, welches hier als alpha-delta-Bungarotoxin eingeführt wird. Es zeigt eine hohe Selektivität für die an der Grenzfläche der alpha-delta-Untereinheiten des muskulären nikotinischen Acetylcholin-Rezeptors gelegene Acetylcholin-Bindungsstelle. Damit ist alpha-delta-Bungarotoxin das erste Toxin aus der Gruppe der langkettigen postsynaptischen Schlangengift-Neurotoxine mit nachgewiesener Bindungsstellen-Selektivität. Diese Eigenschaft in Kombination mit seiner hohen strukturellen Ähnlichkeit zum funktionell gut charakterisierten alpha-Bungarotoxin machen alpha-delta-Bungarotoxin zu einem interessanten Werkzeug für weiterführende Studien von Struktur-Funktions-Beziehungen an den Grenzflächen der Untereinheiten nikotinischer Rezeptoren sowie für die Charakterisierung von Rezeptor-Subtypen. Die Analyse alpha-Bungarotoxin und alpha-delta-Bungarotoxin codierender genomischer DNA-Sequenzen dokumentierte drei neue alpha-Bungarotoxin-Isoformen, etablierte alpha-delta-Bungarotoxine als eigene Toxingruppe mit bisher vier Isoformen aus zwei Spezies und demonstrierte das regionale Einwirken positiver Selektion und beschleunigter molekularer Evolution auf diese Rezeptorantagonisten, was zu einer durch Genduplikation angetriebenen funktionellen Diversifizierung mit nachfolgender Konservierung besonders wirksamer Toxine führte. Mit der Sequenzierung mitochondrialer Genabschnitte historischer Museumsexemplare aus dem 19. Jahrhundert gelang die Charakterisierung einer birmanischen Gruppe von Kraits, innerhalb derer drei neue Arten identifiziert wurden, sowie die Abgrenzung einer neu entdeckten Art aus Vietnam, deren Erstbeschreibung im Rahmen dieser Arbeit erfolgte. Die taxonomische Eigenständigkeit auf dem Artniveau für südasiatische Kraits mit 17–19 Reihen von Dorsalschuppen um den Körper (B.-sindanus-Komplex) wird bestätigt. Die Enthüllung kryptischer Artenvielfalt und genetischer Diversität sowie die große Vielfalt der Bungarus-Toxine bei geringer zwischenartlicher Übereinstimmung stellen eine große Herausforderung für die klinische Medizin und die Produktion von Antisera dar. Sie zeigen auf, dass der taxonomischen Identifizierung bissverursachender Schlangen im klinischen Bereich ebenso wie der Frage der Neutralisationswirkung von Antisera und der Auswahl zur Giftproduktion verwendeter Schlangen in Zukunft eine wesentlich größere Rolle beigemessen werden muss. Zugleich bietet die große molekulare Diversität der Bungarus-Toxine aber auch die Chance, neue Sonden zur Erforschung der Struktur von Acetylcholinrezeptoren und zu deren diagnostischer Markierung zu finden.