Open Access

Ina Takac

• NADPH-Oxidasen der Nox-Familie sind eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen species) in verschiedenen Geweben und Zellen. Die Isoformen der NADPH-Oxidase unterscheiden sich dabei in ihrer physiologischen Funktion: Während Nox1 und Nox2 eher akute, Agonisten-induzierte ROS-Signaltransduktion vermitteln, sind Nox4-abhängig produzierte ROS an chronischen Prozessen wie Differenzierung beteiligt. Die Isoformen der NADPH-Oxidase unterscheiden sich darüber hinaus in ihrer intrazellulären Lokalisation, der Art der Aktivierung und der Spezies der abgegebenen ROS. Nox1 muss durch die Interaktion mit zytosolischen Untereinheiten (NoxA1 und NoxO1) aktiviert werden und produziert dann hauptsächlich Superoxidanionradikale (O2-). Nox4 dagegen ist unabhängig von zytosolischen Untereinheiten und somit konstitutiv aktiv und setzt eher Wasserstoffperoxid (H2O2) in den Extrazellulärraum frei. Zwischen diesen Unterschieden, deren strukturelle Ursachen weitgehend unbekannt sind, und den unterschiedlichen Funktionen von Nox1 und Nox4 besteht wahrscheinlich ein Zusammenhang. In transfizierten HEK293-Zellen konnte zunächst durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie und subzelluläre Fraktionierung gezeigt werden, dass Nox1 in der Plasmamembran lokalisiert ist und Nox4 in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) verbleibt. Um die strukturellen Unterschiede zwischen Nox1 und Nox4, die eine Rolle bei der intrazellulären Lokalisation, den Aktivierungsmechanismen und der Art der abgegebenen ROS spielen könnten, zu identifizieren, wurden chimäre Proteine aus Nox1 und Nox4 konstruiert und analysiert. Zunächst konnte gezeigt werden, dass die konstitutive Aktivität von Nox4 durch den zytosolischen Bereich vermittelt wird. Dafür ist allerdings der komplette zytosolische Bereich ab der 6. Transmembrandomäne nötig, chimäre Konstrukte mit einem kürzeren Anteil des zytosolischen Bereichs von Nox4 waren nicht aktiv. Für die Aktivierung von Nox1 dagegen ist der zytosolische Bereich nicht ausreichend, vermutlich spielen weitere Interaktionen mit Bereichen im transmembranen Teil des Proteins ebenfalls eine Rolle. Für die korrekte intrazelluläre Lokalisation benötigen Membranproteine ein N-terminales Signalpeptid. Wenn das vorhergesagte Signalpeptid von Nox1 durch das von Nox4 ausgetauscht wurde, zeigte dieses chimäre Protein keine Plasmamembran-Lokalisation mehr, es war stattdessen in vesikelähnlichen Strukturen unterhalb der Plasmamembran lokalisiert. Das Signalpeptid von Nox1 war nicht dazu in der Lage, Nox4 zur Plasmamembran zu transportieren, das Protein war weiterhin im ER lokalisiert, was darauf hindeutet, dass Nox4 noch weitere Mechanismen besitzt, die seine ER-Lokalisation bedingen. Der Austausch des Signalpeptids von Nox4 gegen das von Nox1 führte dazu, dass das chimäre Protein statt H2O2 O2- produzierte. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass der N-Terminus von Nox4 bei der H2O2-Produktion eine Rolle spielt. Experimente mit Nox1 und Nox4 mit N-terminalem Myc-Tag deuteten darauf hin, dass nur der N-Terminus von Nox1 prozessiert wird, also dass das Signalpeptid während der co-translationalen Translokation abgespalten wird. Ohne Signalpeptid waren sowohl Nox1 als auch Nox4 inaktiv. Die dritte extrazytoplasmatische Schleife von Nox4 enthält 28 zusätzliche Aminosäuren verglichen mit Nox1, die sich auf zwei Bereiche aufteilen. Eine Deletion der Aminosäuren, die nur in Nox4 vorhanden sind, führte dazu, dass das Protein O2- anstelle von H2O2 produzierte, ohne dass die intrazelluläre Lokalisation verändert wurde. Zwei konservierte Cysteine innerhalb der deletierten Bereiche scheinen bei diesem Prozess eine Rolle zu spielen, vermitteln den Effekt aber nicht alleine, da nach Mutation dieser Cysteine die Umkehr der ROS-Produktion nicht ganz so stark war wie bei der Deletion der kompletten Bereiche. In Nox1 sind die Cysteine wahrscheinlich in die Aktivierung des Proteins involviert, da deren Mutation die Aktivität von Nox1 reduzierte. Der N-Terminus und die dritte extrazytoplasmatische Schleife von Nox4 sind somit an einem Prozess beteiligt, der die H2O2-Produktion von Nox4 vermittelt. Die entsprechenden Abschnitte in Nox1 scheinen andere Funktionen zu erfüllen. Das Signalpeptid von Nox1 ist für die korrekte intrazelluläre Lokalisation in der Plasmamembran verantwortlich; die dritte extrazytoplasmatische Schleife ist wahrscheinlich an der Aktivierung des Proteins beteiligt. In dieser Arbeit konnten also strukturelle Unterschiede zwischen Nox1 und Nox4 in verschiedenen Bereichen der Proteine identifiziert werden, die für die unterschiedliche intrazelluläre Lokalisation und die Art der produzierten ROS verantwortlich sind.
• NADPH oxidases of the Nox family are important sources of reactive oxygen species (ROS) in several tissues and cells. The isoforms of the NADPH oxidase differ in their physiological function: Nox1 and Nox2 mediate acute agonist-induced ROS dependent signaltransduction whereas Nox4-derived ROS are involved in chronic processes like differentiation. Moreover, the isoforms differ in their intracellular localization, mode of activation and the type of ROS released. Nox1 has to be activated by cytosolic subunits (NoxA1 and NoxO1) and produces predominantly superoxide anions (O2-). Nox4 instead is independent of cytosolic subunits and constitutively active. It releases primarily hydrogen peroxide (H2O2) to the extracellular space. These differences, whose structural basis is unknown, are probably linked to the different functions of the Nox proteins. In this study performed in transfected HEK293 cells, it was shown by immunofluorescence microscopy and subcellular fractionation that Nox1 is localized in the plasma membrane and Nox4 is retained in the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). To identify the structural differences between Nox1 and Nox4 that might play a role in intracellular localisation, mechanisms of activation and the type of ROS released, chimeric proteins consisting of different parts of Nox1 and Nox4 were constructed and analyzed. It was demonstrated that the constitutive activity of Nox4 is mediated by the cytosolic tail and that the whole tail from the end of the 6th transmembranedomain is required, since chimeric proteins with shorter portions of the cytosolic tail of Nox4 did not produce any ROS. In contrast, for the activation of Nox1 the cytosolic tail is not sufficient, and probably further interactions with regions in the transmembranous part of the protein play an additional role. For the proper intracellular localization of membrane proteins a N-terminal signal peptide is required. When the predicted signal peptide of Nox1 was replaced by that of Nox4, this chimeric protein did not show localization to the plasma membrane anymore, instead it was retained in vesicle-like structures below the plasma membrane. The signal peptide of Nox1 failed to translocate Nox4 to the plasma membrane, the protein was still seen in the ER, suggesting that Nox4 contains further properties responsible for the localization in the ER. The type of ROS released by this chimeric protein however was altered – the protein produced O2- instead of H2O2. This result indicates that the N-Terminus of Nox4 is involved in H2O2-production. Experiments with N-terminally Myc-tagged Nox1 and Nox4 implied that only the N-Terminus of Nox1 is processed, meaning that the signal peptide is cleaved during co-translational translocation. Without the signal peptide Nox1 and Nox4 were both inactive. The third extracytoplasmic loop in Nox4 contains 28 additional aminoacids compared to the loop in Nox1, which are divided into two regions. Deletion of the aminoacids present only in Nox4 had the same effect as the exchange of the signal peptide of Nox4 with the one of Nox1: the protein switched from O2-- to H2O2-production without changing the intracellular localization. Two conserved cysteines within the deleted regions seem to play a role in this process, but they do not mediate this effect on their own, since the switch in ROS production was less dominant after mutation of these cysteines compared to the deletion of the two regions. In Nox1 however, mutation of the analogous cysteines reduced the activity of the protein, suggesting that these aminoacids are involved in the activation of Nox1. Thus, the N-Terminus and the third extracytoplasmic loop of Nox4 are involved in a mechanisms mediating H2O2-production. The corresponding regions in Nox1 seem to have different function. The signal peptide is responsible for the correct intracellular localisation in the plasma membrane, whereas the third extracytoplasmic loop is probably involved in the activation of the protein. In this work structural differences between Nox1 and Nox4 were identified in several regions of the proteins, which account for the diverse intracellular localization and the type of ROS produced.