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Johannes Ludwig

• Hintergrund: Epilepsie bezeichnet eine Erkrankung, welche durch eine anhaltende Prädisposition für Symptome, die im Zusammenhang mit einer ungewöhnlich starken oder synchronisierten elektrischen Aktivität des Gehirns auftreten (=epileptischer Anfall) charakterisiert ist. Mutationen in dem Gen DEPDC5 (Dishevelled, Egl-10 and Pleckstrin (DEP) domain-containing protein 5) sind mit fokalen Epilepsien assoziiert und führen in Tiermodellen und humanen Modellen zu einer Überaktivierung des mTOR-Signalweges. Auf neuromorphologischer Ebene zeigt sich die mTOR-Überaktivierung durch eine Vergrößerung des Zelldurchmessers und einer zunehmenden Verästelung der Neuriten. Ziel dieser Studie war es, die morphologischen Auswirkungen der DEPDC5-assoziierten mTOR-Überaktivierung in der SH-SY5Y-Neuroblastomzelllinie zu untersuchen. Dadurch soll eine Einschätzung getroffen werden, ob das im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen bereits gut etablierte SH-SY5Y-Zellmodell auch bei der Untersuchung epilepsieassoziierter Pathomechanismen zum Einsatz kommen kann. Methoden: Unter Einsatz der CRISPR/Cas9-Methode wurden Knockout(KO)-Mutationen in Exon 2 und Exon 3 des DEPDC5-Gens erzeugt und diese mittels Sanger-Sequenzierung bestätigt. Danach wurden die Knockouts auf RNA- und Proteinebene, durch Real-time-RT-PCR und Western Blot validiert. Die bestätigten homozygoten DEPDC5-KO-Zelllinen wurden anschließend mittels Western Blot auf eine mTOR-Überaktivierung untersucht. Zuletzt erfolgte die neuromorphologische Validierung des DEPDC5-KO. Die Zellgröße proliferierender SH-SY5Y wurden mittels Durchflusszytometrie (FACS) untersucht. Zudem bestimmten wir die neuronale Architektur differenzierter SH-SY5Y unter Einsatz der Sholl-Analyse. Ergebnisse: Es konnten vier unabhängige DEPDC5-KO-SH-SY5Y-Zelllinien mit homozygoten Indel-Mutationen und vorzeitigem Stoppcodon in Exon 3 generiert werden. Die erwartete Reduktion an DEPDC5-mRNA konnte mittels Real-time 10 RT-PCR nicht festgestellt werden. Die Abwesenheit des Proteins konnte durch Western Blot aber gezeigt werden. Funktionell konnte für alle Zelllinien eine mTOR-Überaktivierung mittels Western Blot nachgewiesen werden. Dabei konnte phosphoryliertes AKT (AKT serine/threonine kinase 1) als stabilster Marker etabliert werden. Auf neuromorphologischer Ebene ließ sich ein Trend in Richtung vergrößertem Zelldurchmesser bei verlängertem Auswachsen der Neuriten feststellen, wobei sich für das Modell Unterschiede zwischen den einzelnen Klonen ergaben. Diskussion: In dieser Studie gelang es erstmals, den Zusammenhang zwischen DEPDC5-KO und einer mTOR-Überaktivierung in der onkogenen SH-SY5Y-Zelllinie zu replizieren. Das verlängerte Auswachsen der Neuriten, bei jedoch gleichbleibender Anzahl peripherer Verästelungen, stellt dabei einen neuen Befund dar und könnte durch die frühe neuronale Entwicklungsstufe des SH-SY5Y-Zellmodells erklärt werden. Auf Grundlage der Ergebnisse dieser Arbeit lässt sich sagen, dass das robuste und kostengünstige SH-SY5Y-Zellmodell insbesondere für high-throughput Methoden und Screeningassays ein geeignetes Modell ist. Durch die Kombination mit reiferen Zellmodellen, wie beispielsweise iPSCs (induced pluripotent stem cells), könnte der Phänotyp eines DEPDC5-KO und anderer mTOR-assoziierter Epilepsien, möglichst umfassend in-vitro dargestellt werden.
• Introduction: Epilepsy is a common neurological disorder, where symptoms are caused by excessive electrical activity referred as epileptic seizures. Loss-of-function mutations of DEPDC5 (Dishevelled, Egl-10 and Pleckstrin (DEP) domain-containing protein 5) have been shown to result in mTOR-hyperactivation in human and animal models and are associated with focal epilepsies. Neuromorphological models of mTOR-hyperactivation show bigger soma size and higher neurite branching complexity. Therefore, the goal of this study was to investigate the impact of a DEPDC5-related mTOR-hyperactivation on SH-SY5Y neuroblastoma cells to evaluate SH-SY5Y as potential cellular model for further epilepsy research. Methods: We used a CRISPR/Cas9-method to induce mutations in exon 2 and exon 3 of the DEPDC5 gene in SH-SY5Y. Potential DEPDC5-knockout(KO)-cell lines were then validated using DNA sequencing, real-time-RT-PCR and western blot. All validated DEPDC5-KO-SH-SY5Y were functionally validated for mTOR-hyperactivation by western blot. Furthermore, we analyzed the soma size of proliferating DEPDC5-KOs using fluorescence-activated-cell-sorting (FACS) and confirmed differences in the neuronal architecture of differentiating SH-SY5Y with Sholl-analysis. Results: We generated four independent DEPDC5-KO-SH-SY5Y-cell lines with homozygous indel-mutations resulting in a frameshift mutation in exon 3. We didn’t see reduction of DEPDC5 mRNA, but DEPDC5 protein was absent in western blotting for all KO-SH-SY5Y cell lines. Functional analysis showed mTOR-hyperactivation, with p-AKT being the most stable marker. Neuromorphological analysis showed high clonal variability with a trend towards increased soma size and longer neurite outgrowth. Discussion: This is the first study replicating the influence of DEPDC5-KO related mTOR-hyperactivation in the human SH-SY5Y cell line. In contrast to most of the published models Sholl-analysis showed longer neurite outgrowth, but no increased neuronal branching, which could be explained by the early developmental stage that can be mimicked by differentiation of SH-SY5Y. We conclude that the robust and cost-effective SH-SY5Y cell line is an effective model especially for high-throughput methods and screening assays. However, the large variability should be addressed in future studies. The combination of SH-SY5Y with more mature cell lines like iPSCs (induced pluripotent stem cells) might thus be the most precise tool to investigate the in-vitro phenotype of DEPDC5-KO and other mTOR-associated epilepsies.