Open Access

Verena Ludwig

• In den letzten Jahren wurde deutlich, daß mRNAs regulatorische Elemente aufweisen.Ein Beispiel hierfür ist z. B. die Transkription des Human Immunodeficiency Virus Typ1 (HIV-1). Die Arginin-reiche Domäne des Tat-Proteins interagiert hierbei mit einer Bindungstelle innerhalb der Bulge-Region der TAR-RNA. Das Vorliegen des hochkonservierten Tat-TAR-Komplexes ist die Voraussetzung für die effiziente Transkription viraler Gene. Eine kompetitive Bindung synthetischer Liganden an die Bulge-Region sollte daher den viralen Vermehrungszyklus unterbrechen. Hochspezifische Liganden mit inhibitorischem Potential sind somit von größtem Interesse. Für eine hohe Liganden-Affinität sind neben ionischen Wechselwirkungen und HBrücken-Interaktionen vor allem auch Stapelwechselwirkungen (stacking) von entscheidender Bedeutung. Die Ligandensuche wurde auf Tripeptide fokussiert. Da die Anzahl natürlich vorkommender aromatischer Aminosäuren sehr limitiert ist,erfolgte im Rahmen dieser Arbeit zunächst eine stereoselektive Synthese von neuen,nicht-natürlichen Aminosäuren mit heteroaromatischen Seitenketten. Um den generellen Einsatz dieser Bausteine in kombinatorischen Bibliotheken zu demonstrieren,wurden zunächst Tripeptide des Musters Arg-X-Arg hergestellt. Bereits diese Tripeptide zeigten in einem Fluoreszenz-Assay inhibierende Effekte auf den Tat- TAR-Komplex von HIV-1 mit IC50-Werten von 2 - 80 µM. Diese vielversprechenden Liganden wiesen auch in einem Tat-TAR kontrollierten Reportergen-Assay stark inhibierende Wirkung in den Zellkulturen auf. Am Beispiel eines Peptides ließ sich mittels NMR-Spektroskopie eine Komplexkonformation bestimmen, die der des bekannten TAR-Argininamid-Komplexes entspricht. Durch den Einsatz von nichtnatürlichen und Standard-Aminosäuren in kombinatorischen Tripeptidbibliotheken (split and combine-Methode) konnte die Suche von potentiellen Peptid-Liganden um ein Vielfaches erweitert werden. Über ein on-bead-Screening ließen sich weitere vielversprechende TAR-bindende Tripeptide identifizieren. Die RNA-Ligandensuche wurde desweiteren auf die psi-RNA (HIV-1) und auf die mRNA des onkogenen bcr-abl Proteins ausgeweitet. Auch hier konnten einige RNA-bindende Tripeptide isoliert werden.
• In the last couple of years it became clear that many mRNAs contain regulatory elements. Complex formation of the TAR-RNA and the tat protein for instance is crucial for the efficient transcription of HIV genes. The goal of this thesis was the synthesis of peptidic tat antagonists. Apart from electrostatic interactions, stacking was found to be fundamental for the molecular recognition of RNA. Because of the limited number of aromatic amino acids given by nature, this work was focused on the synthetic access to a broad scope of aromatic and heteroaromatic analogues. Five non-natural amino acids could be synthesized by a stereoselective total synthesis. To demonstrate the applicability of the new amino acids for solid phase synthesis, tripeptides following the pattern Arg-X-Arg were prepared. These tripeptides were also tested for their binding affinity to HIV-1 TAR-RNA by a fluorescence assay and compared with naturally occuring ligands. The new peptides showed IC50 values between 2 and 80 µM. Additionally, when tested in tat-TAR controlled reporter gene assay, strong inhibiting effects could be verified. By NMR spectroscopy a complex formation similar to the well-known TAR-argininamide complex was determined for one of the tripeptides. Using non-natural and standard amino acids as building blocks in combinatorial tripeptide libraries allowed to screen a large number of posssible RNA-binders in parallel. On-bead-screening lead to promising TAR-binding tripeptides in a straightforward manner. Apart from focussing on TAR-ligands, the search was also extended to other targets such as psi-RNA (HIV-1) and the mRNA of the oncogene bcr-abl protein. Again, many RNA-binding tripeptides were identified, demonstrating the versatility of this screening method.