Structure-function relationships in the cytochrome bc1 complex from Saccharomyces cerevisiae

Strukturelle und funktionelle Untersuchungen am Cytochrom-bc1-Komplex zur Klärung des molekularen Wirkungsmechanismus

  • The cytochrome bc1 complex is a cornerstone in bioenergetic electron transfer chains, where it carries out tasks as diverse as respiration, photosynthesis, and nitrogen fixation. This homodimeric multisubunit membrane protein has been studied extensively for several decades and the enzyme mechanism is described with the modified protonmotive Q cycle. Still, the molecular and kinetic description of the catalytic cycle is not complete and questions remain regarding the bifurcation of electron transfer at the quinol oxidation (Qo) site, substrate occupancy, pathways of proton conduction, and the nature of the Rieske protein domain movement. We used competitive inhibitors to study the molecular architecture at the Qo site with X-ray crystallography. The structure of the enzyme with the substrate analog 5-n-heptyl-6-hydroxy-4,7-dioxobenzothiazole (HHDBT) bound at the Qo site was determined at 2.5 Å resolution. Spectroscopic studies showed that HHDBT is negatively charged when bound at the active site. Mechanistic interpretations from inhibitor binding are in line with single occupancy model for quinol oxidation and structural analysis supports the proposed proton transfer pathway. For functional insight into the enzyme mechanism, redox-sensitive protonation changes were studied by Fourier transform infrared spectroscopy. The protein purification procedure was optimized for less delipidation and the isolated enzyme was more active. Furthermore, two new phospholipids were identified in the X-ray structures, including a cardiolipin. Strikingly, conserved lipid binding cavities were observed in structural comparison with homologous enzymes. The functional role of tightly bound phospholipids will be discussed. Finally, the Qo site is a target for various compounds of agricultural and pharmaceutical importance. Importantly, the X-ray structures permit detailed analysis of the molecular reasons for acquired resistance to and treatment failure of Qo site inhibitors, such as atovaquone, that is used to treat malaria and pneumonia, as discussed herein.
  • Der Cytochrom-bc1-Komplex ist eine essentielle Komponente von Elektronen-transportketten in Eukaryoten und Prokaryoten, wo er an verschiedenen bioenergetischen Prozessen wie der Atmungskette, der Photosynthese und der Stickstoffixierung beteiligt ist. Der Mechanismus dieses Enzyms ist in seinen Grundzügen charakterisiert und mit dem Model des modifizierten Q-Zyklus beschrieben. Jedoch sind Regulationsprozesse und insbesondere der molekulare Mechanismus der Ubichinoloxidation immer noch unverstanden. Um den molekularen Mechanismus der Katalyse in der Qo-Bindungsstelle zu untersuchen, wurde der Bindungsmodus des Qo-Inhibitors HHDBT mittels der Röntgenkristallographie bestimmt. Diese 2.5 Å Kristallstruktur erlaubte wichtige Rückschlüsse auf den Katalysemechanismus. Vorherigen kristallographischen Arbeiten am UHDBT-Inhibitorkomplex waren nicht erfolgreich und führten nicht zu einer hochaufgelösten Struktur. Unter Verwendung von Heptyl-HDBT, das eine kürzere Alkyl-Kettenlänge aufweist, wurden erfolgreich dreidimensionale Kristalle des Komplexes gezüchtet. Dieses Hydroxychinon bindet in seiner ionisierten Form, entgegen vorherigen Behauptungen, dass eine ionisierte Verbindung nicht in der katalytischen Substrattasche binden könne. Demnach weisen unsere Studien darauf hin, dass die pH-Abhängigkeit der alkyl-HDBT Inhibierung durch eine dissoziierbare Gruppe im Komplex, vermutlich den Liganden des [Fe-2S]-Zentrums His181, bewirkt wird und nicht durch eine Verringerung der Inhibitoreffizienz durch Deprotonierung der Hydroxylgruppe. Die strukturelle Ähnlichkeit zu Ubichinol und die kompetitive Hemmung der Qo-Bindungsstelle erlauben es, HHDBT als Substratanalogon zu betrachten. Die Konformationsänderungen an der Bindungsstelle unterstützen den zuvor postulierten Protonentransferweg und offenbaren die Plastizität der katalytischen Bindungsstelle. Aus dem beobachteten Bindungsmodus des Hydroxychinon-Anions und dem Protonentransferweg wurde ein katalytischer Mechanismus abgeleitet, der sich mit dem Modell einer einfachen Besetzung der Ubichinol-Oxidationstasche in Einklang bringen lässt. Um das vorgeschlagene mechanistische Modell zu überprüfen, wurde die FTIR- Spektroskopie eingesetzt. Diese Studie zeigte zum ersten Mal, dass die Bindung der Inhibitoren HHDBT und Stigmatellin den Protonierungszustand und/oder die Orientierung von sauren Seitenketten beeinflusst. Des weiteren wurde die Interaktion der Stigmatellin Carbonylgruppe mit dem Enzym nachgewiesen. Die Röntgenkristallstrukturen der Hefe Cytochrom-bc1-Komplexe mit gebundenen HHDBT oder Stigmatellin in der Qo-Bindungsstelle sind wertvoll um die molekularen Ursachen menschlicher Krankheiten zu verstehen, die auf Mutationen im Cytochrom b zurückzuführen sind. Ebenfalls von großer Bedeutung sind diese Strukturen für die gezielte Entwicklung von Pestiziden oder pharmazeutischen Wirkstoffen, die gegen das aktive Zentrum der Komplexe in Parasiten oder Pilzen gerichtet sind. Zielorganismen entwickeln oft eine Resistenz gegenüber diesen Wirkstoffen. Bei einem Vergleich von Cytochrom-bc1-Komplex Strukturen von Hefe und Rind, mit verschiedenem Besetzungsgrad der Chinon-Bindungsstellen wurde die Plastizität der Qo-Bindungsstelle beobachtet. Basierend auf dem HHDBT Bindungsmodus in der Qo-Bindungsstelle wurde die Interaktion mit z.b. dem Antimalariawirkstoff Atovaquone modelliert. Die strukturellen Grundlagen von dessen Spezies-spezifischer Wirkung können so diskutiert werden. Ein weiteres Ergebnis der Doktorarbeit war die Optimierung der Proteinreinigung im Hinblick auf eine geringere Delipidierung der Proteinprobe und eine vergrößerte Kapazität. Dabei wurde die Ausbeute verbessert sowie die spezifische Enzymaktivität des gereinigten Proteins erhöht. So konnten zwei neue Phospholipidmoleküle reproduzierbar in unterschiedlichen Datensätzen identifiziert werden. Eine Analyse des Bindungsmodus von fest gebundenen Lipiden in Membranproteinstrukturen wurde durchgeführt. Es wurden hierbei spezifische Bindungsmuster für die Stabilisierung der Interaktionen zwischen den Phosphodiestergruppen und den Seitenketten der Aminosäurereste identifiziert. Eine bevorzugte Stabilisierung der Phospholipide auf der negativen Seite der Membranen wurde beobachtet. Die in der Kristallstruktur identifizierten, spezifisch gebundenen Phospholipide, die an Interaktionsflächen von Proteinuntereinheiten auftreten, weisen auf eine wichtige Rolle für die strukturelle Integrität des Komplexes hin. Eine vergleichende Analyse der Lipidbindungsstellen in Strukturen homologer Proteine wurde durchgeführt und zeigte, dass sie Spezies-übergreifend konserviert sind. Die Röntgenstrukturen des Cytochrom-bc1-Komplexes bieten die Grundlage für detaillierte Struktur-Funktions-Studien zur Beschreibung der molekularen katalytischen Vorgänge. Sie fördern aufregende Entdeckungen für das tiefere Verständnis der fundamentalen Prozesse des Lebens, welche durch diesen Typ der Enzyme katalysiert werden.

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Metadaten
Author:Hildur Palsdottir
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000005863
Referee:Bernd LudwigGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2005/04/04
Year of first Publication:2004
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2005/01/21
Release Date:2005/04/04
Tag:Q cycle; Qo site; antibody Fv fragment; membrane protein; oxidative phosphorylation
GND Keyword:Ubihydrochinon-Cytochrom-c-Reductase; Atemwege; Phospholipide; FT-IR-Spektroskopie; Röntgenkristallographie
HeBIS-PPN:127700730
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht