Isolierung, Kultivierung, Charakterisierung proximaler und distaler Tubuluszellen der menschlichen Niere

  • Hauptziel dieser Arbeit war die Etablierung einer Methode zur Isolierung und Kultivierung proximaler und distaler Tubuluszellen der menschlichen Niere. Dabei wurde neben einer hohen Zellausbeute besonderer Wert auf die Reinheit der Nierenzellkulturen gelegt. Um dieses Ziel zu erreichen wurden mehrere Isolationsschritte hintereinander durchgeführt. Um eine homogenen Zellsuspension aus dem Nierenexzisat zu erhalten wurde eine mechanische Zerkleinerung und anschließend eine enzymatische Andauung durchgeführt. Dabei war ein Enzymgemisch aus Collagenase IV und DNase I mit nachfolgender Andauung mit Hyaluronidase am erfolgreichsten. Um größere Zellverbände auszuschließen wurde das Zellgemisch anschließend durch ein Stahlsieb filtriert. Durch die Percoll Dichtegradientenzentrifugation konnten die Zellen in einem weiteren Schritt separiert werden. Dadurch konnten z.B Erythrozyten, Granulozyten und ein Teil der Lymphozyten verworfen werden. Durch die unterschiedliche Antigenstruktur der Oberflächenmembran proximaler und distaler Tubuluszellen konnten mit Hilfe von monoklonalen Primär und Sekundärantikörpern, welche magnetisch markiert waren, die proximalen und distalen Tubuluszellen separiert werden. Mit Hilfe dieses immunomagnetischen Verfahrens wurden erstmals proximale und distale Tubuluszellen der menschlichen Niere in hoher Reinheit und Vitalität isoliert. Damit zeigte sich dieses Verfahren, welches bisher fast ausschließlich zur Isolierung von Blutzellen eingesetzt wurde, auch bei der Isolierung von Tubuluszellen der menschlichen Niere als erfolgreich. Die zu verschiedenen Zeitpunkten der Zellisolierung eingesetzte Immunfluoreszenzfärbung zeigte, im Vergleich zum Durchlicht, nach der Percoll Dichtegradientenzentrifugation eine Markierung von ca. 30% der Zellen. Nach der Separierung der Zellen durch die Microbeads waren fast alle Zellen (95%) markiert. Die sich anschließende Kultivierung proximaler und distaler Tubuluszellen zeigte ein einheitliches Wachstumsmuster. Beide Zellarten zeigten nach 3-4 Tagen die Bildung kleiner Kolonien, und nach 7-10 Tagen die Bildung eines homogenen Monolayers. Nach ca. 20 Tagen zeigten die Zellen eine stärker werdende Granulierung des Zytoplasmas. Nach ca. 30 Tagen stellten die Zellen das Wachstum ein und starben ab. Um die Kulturen der proximalen und distalen Tubuluszellen zu charakterisieren wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Immunfluoreszenzfärbungen, und Enzymbestimmungen im Überstand und auf den Zellen direkt durchgeführt. Dabei konnten die charakteristischen Enzymmuster und Oberflächenantigene nur für eine Zeitspanne von ca. 7 Tagen in Kultur nachgewiesen werden.

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Metadaten
Author:Anita Balser-Kutt
URN:urn:nbn:de:hebis:30-0000005971
Referee:J. E. Scherberich
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2005/03/18
Year of first Publication:1999
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2004/12/13
Release Date:2005/03/18
HeBIS-PPN:127415831
Institutes:Medizin / Medizin
Dewey Decimal Classification:6 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften / 61 Medizin und Gesundheit / 610 Medizin und Gesundheit
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht