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Karen Geßner

• Bei der in vitro Rückfaltung von entfaltetem, reduziertem Hirudin entstehen neben dem nativen Protein hauptsächlich zwei nicht-nativ gefaltete Konformere. Das Verhältnis von nativem und nicht-nativem Konformer lässt sich während der Rückfaltung durch verschiedene Parameter beeinflussen. Thiole wie reduziertes Glutathion (GSH), N-Acetylcystein (NAC) und Dithioerytritol (DTE) beeinflussten die in dieser Arbeit untersuchten Rückfaltungen auf verschiedene Weise. Während beim Zusatz von GSH sehr verstärkt die Bildung des nativen Konformers auftrat, wurde bei einem Zusatz von NAC und DTE einerseits ein leicht verbessertes Verhältnis von nativem zu nicht-nativem Konformer festgestellt, andererseits wurde aber eine stark vermehrte Oligomerbildung beobachtet. Die aufgestellte Theorie der Oligomerbildung konnte anhand graphischer Auswertung der zusätzlich auftretenden, im Nativgel höher laufenden Banden bestätigt werden. Bei Zusatz von GSH und GSSG (oxid. Glutathion) als Redoxpuffer im Molekülverhältnis 2:1 (10 mM) wurde bei 4°C eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin erreicht. Der Zusatz von 1 mM GSH bewirkte dagegen bei 28°C (höchste gewählte Temperatur) ebenfalls eine vollständige Rückfaltung zum nativen Hirudin-Konformer. Die Temperaturabhängigkeit der Rückfaltung zeigte sich auch in weiteren Untersuchungen. So ergaben die Rückfaltungen unter Zusatz von 1 mM DTE, NAC und 10 mM GSH bei 4°C eine wesentlich höhere Ausbeute an nativ gefaltetem Hirudin als bei höheren Temperaturen. Der pH-Wert im Bereich von 4,0 bis 8,0 veränderte das Rückfaltungsmuster von Hirudin in den durchgeführten Untersuchungen nicht, obwohl Literaturdaten auf ein pH-Optimum von 8-9 für erfolgreiche Rückfaltungen hindeuten. Nativ und nicht-nativ gefaltetes Hirudin sowie die ebenfalls während der Rückfaltung entstandenen Oligomere ließen sich HPLC-chromatographisch trennen. Die in den Nativgelen auftretende, sehr übereinanderliegende Doppelbande des nicht-nativen Hirudins konnte per HPLC in zwei verschiedenen Konformere getrennt werden. Eine positive Beeinflussung der in vitro-Rückfaltung von Hirudin durch einen Zusatz der Oxidoreduktase Thioredoxin konnte eindeutig nachgewiesen werden. Bei einem äquivalenten Gehalt an Tioredoxin wurde die Rückfaltung zum nativen Konformer eindeutig begünstigt. Ein katalytischer Gehalt an Thioredoxin (Thioredoxin:Hirudin im Verhältnis 1:10) bewirkte die Rückfaltung ausschließlich zu nativem Hirudin. Auch bei einem Zwanzigstel Äquivalent Thioredoxin war noch eine positive Beeinflussung feststellbar. Bei einer S. lividans-Expression von Hirudin über ein pAX5a-Derivat wurde fast ausschließlich nicht-nativ gefaltetes Hirudin produziert. Die nicht-native Faltung war in einem Nativgel deutlich von der nativen, aktiven Form des Inhibitors zu unterscheiden. Durch Zusätze von reduziertem (GSH) und oxidiertem Glutathion (GSSG) zum Wachstumsmedium konnte der Anteil an nativem Hirudin erhöht werden. Die Zusätze beeinflussten aber stark die Gesamtausbeute des sekretierten Proteins. So wurden unter Zugabe von 1 mM GSH Ausbeuten von 200 mg/L Hirudin erreicht, davon 2 mg/L natives Protein. Die Gegenwart von verschiedenen Verhältnissen von GSH und GSSG (Gesamtkonzentration 1mM Thiol) reduzierte die Hirudinproduktion auf 20 – 32 mg/L, darunter war kein erkennbarer Anteil an nativem Hirudin. Ein Zusatz von gleichen Verhältnissen von GSH und GSSG in höherer Konzentration (10 mM) resultierte in einer Steigerung des Anteils an nativem Inhibitor auf 14 %, die Gesamtausbeute an Hirudin sinkt aber deutlich (15 mg/L insgesamt, 2 mg/L natives Protein). Die Oxidoreduktase Thioredoxin wurde ebenfalls über ein pAX5a-Derivat in S. lividans-Kultivierungen mit einer Ausbeute von 65 mg/L gewonnen. Eine Coexpression von Thioredoxin und Hirudin über ein bicistronisches Gen in einem pAX5a-Derivat resultierte in einer Proteinproduktion von 4 mg/L Thioredoxin und 20 mg/L Hirudin. Obwohl ein Verhältnis von 0,2:1 Moläquivalenten (Thioredoxin:Hirudin) in den in vitro-Rückfaltungen zu 100 % nativ gefaltetem Inhibitor führte, war in den Kultivierungen kein positiver Einfluß des Thioredoxins auf die Hirudinfaltung erkennbar. Die Expression von Thioredoxin setzte zeitlich sehr viel früher als die Hirudin-Expression. Die Produktion von Hirudin über einen integrativen Vektor erzielte 600 - 700 mg/L Protein. Wie in anderen Hirudinkultivierungen ohne Thiolzusatz wurde Hirudin ausschließlich in der inaktiven, nicht-nativen Struktur produziert. Kultivierungen der mit dem integrativen Thioredoxin-Vektor infizierten S. lividans-Zellen erzielten dagegen kein Protein. Die Coexpression von Hirudin und Thioredoxin scheiterte an dem nicht zu generierenden, bicistronischen integrativen Vektor. Um die Isomeraseaktivität des Thioredoxins zu erhöhen und somit eine größere Beeinflussung der Hirudinfaltung zu erzielen, wurden Thioredoxinmutanten hergestellt. Die redoxaktiven CXXC-Zentren der generierten Thioredoxine enthalten die Aminosäuresequenzen der CXXC-Motive von E. coli DsbA und DsbC und humanem PDI. Die Expression aller Mutanten gelang in zwei verschiedenen Medien. Eine Isolierung und Anwendung der gereinigten Mutanten in der Hirudinfaltung wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt. Die Konstrukte stehen für weitere Arbeiten zur Verfügung. In vergleichenden Expressionen mit fünf verschiedenen Signalsequenzen wurden sowohl das homologe Streptomyces-Protein Tendamistat als auch das heterologe Hirudin über jeweils alle Signalpeptide exprimiert. Tendamistat wurde schon zu Beginn der exponentiellen Wachstumsphase exprimiert Innerhalb der verschiedenen Kultivierungen wurden unterschiedlich hohe Expressionswerte erreicht. Eine ausgeprägte Anreicherung von Vorläufer-Proteinen in der Zelle fand nicht statt. Neben dem vorwiegend nativ prozessierten Tendamiastat zeigte eine Analyse der Massendaten eine teilweise falsche Prozessierung der AxeA-, CelB- und SnpA-Signalpeptide. Hirudin konnte ebenfalls über alle fünf Signalpeptide exprimiert werden. Dabei wurde fast quantitativ nicht-nativ gefaltetes Hirudin sekretiert. Die Höhe der Expression über die verschiedenen Signalpeptiden war unterschiedlich hoch, wobei die Unterschiede geringer als bei der Tendamistat-Expression waren. Die Massenanalytik belegte, dass die Prozessierung des heterologen Hirudins wesentlich uneinheitlicher erfolgte als die Prozessierung des homologen Tendamistats. Ein Zusammenhang zwischen der Expressionshöhe beider Proteine und verschiedener Strukturmerkmale der Signalpeptide konnte nicht festgestellt werden. So wurde die in der Literatur aufgestellte These, dass in der n-Domäne mindestens zwei Ladungen enthalten sein müssen, in dieser Arbeit nicht bestätigt. Weder die Struktur noch die unterschiedliche Ladung der n-Domäne der Signalpeptide zeigten einen eindeutigen Zusammenhang mit der Expressionshöhe der Proteine. Auch eine Verknüpfung zwischen der Länge der h-Domäne und der Expressionshöhe konnte weder für die Tendamistat- noch für die Hirudinexpression erstellt werden. Die Positionierung von Glutamin an Position –2 innerhalb der c-Domäne schien in der Tendamistatexpression bezüglich der Proteinausbeute von Vorteil zu sein. Bei der Expression von Hirudin wurde ein ähnlicher Trend nicht gefunden. Die Proteinproduktion über ein Signalpeptid mit enthaltenem TTALeu-Codon war entgegen Literaturaussagen möglich und verminderte - wie in der Hirudinexpression gezeigt - nicht automatisch die Expressionshöhe. Bei den Tendamistatkultivierungen wurde dieser Einfluss jedoch deutlich. Theoretische Betrachtungen zur Prozessierung anhand von Rechenmodellen waren hilfreich, um Beobachtungen zu erklären oder zu deuten. So wurde eine Erklärung der zusätzlichen falschen Prozessierung der Sigalpeptide vom homologen und auch vom heterologen Protein über theoretische Modelle wie z. B. eine Schnittstellenberechnung teilweise möglich. Die Überlegungen zum Transmembran-Bereich der Signalpeptide zeigen im Vergleich der Berechnungen für Tendamisitat und Hirudin, dass die Ladung des N-Terminus des anhängenden Proteins ein Rolle bei die Positionierung des Signalpaptids innerhalb der Membran spielt und somit auch für die Präsentation der Schnittstelle und eine erfolgreiche Prozessierung verantwortlich ist. Die bisher verfügbaren Literaturdaten lassen darauf schließen, dass es allgemeine Richtlinien in Bezug auf Aminosäurezusammensetzung, sowie Ladung und Länge der Signalpeptide gibt, deren Mißachtung eine Verringerung der Expressionshöhe von Proteinen bewirken. Diese Richtlinien scheinen aber hauptsächlich bei einzeln eingefügten Mutationen zu bestehen. Werden, wie in dieser Arbeit vorgestellt, ganze Signalpeptide ausgetauscht und die resultierende Expression beobachtet, können viele dieser Vorgaben nicht verifiziert werden oder stimmen nur in Einzelfällen überein. Trotzdem zeigt diese Arbeit, dass theoretische Betrachtungen für Vorhersagen zur Proteinexpression unabdingbar sind.