Open Access

Britta Caroline Sasse

• The development of novel drugs targeting GPCRs is of particular interest since modulation of subfamilies of this receptor class highly influences neurotransmission in the central nervous system. This study has focused on the development of ligands for the dopamine D3 receptor. The receptor belongs to the dopamine D2-like family among the biogenic amine binding GPCRs. The dopamine D3 receptor is involved in neurological and neuropsychiatric disorders such as Parkinson’s disease, schizophrenia and drug addiction. Due to its close structural similarity to the dopamine D2 receptor subtype, it is still a challenge to identify and further optimize new leads. Therefore an in vitro screening assay, which also allows elucidating comprehensive structure-affinity relationships, is required. In this investigation the implementation and evaluation of radioligand binding assays for human dopamine D2S and dopamine D3 receptors and for the related aminergic human histamine H1 receptor stably expressed in Chinese hamster ovary (CHO) cells has been performed. Saturation binding experiments with [³H]spiperone at dopamine D2S and D3 receptors and with [³H]mepyramine at histamine H1 receptors were carried out. The determined equilibrium dissociation constant of radioligands (Kd) and the total number of specific binding sites (Bmax) of the receptor membrane preparations were in good agreement with reference data. Inhibition constants (Ki) of reference ligands obtained in radioligand competition binding experiments at dopamine hD2S, hD3 and histamine H1 receptors validated the reliability and reproducibility of the assay. In order to discriminate agonists from antagonists, a GTP shift assay has been investigated for dopamine D2S and D3 receptors. In competition binding studies at dopamine D2S receptors the high- and low affinity state in the absence of the GTP analogue Gpp(NH)p has been recognized for the agonists pramipexole and the seleno analogue 54. In the presence of Gpp(NH)p a decrease in affinity, referred to as “GTP shift”, has been revealed for agonists at dopamine D2S and D3 receptors. An effect of Gpp(NH)p on dopamine D2S receptor binding has not been observed for the antagonists ST 198 and BP 897, while a reverse “GTP shift” has been noticed at the dopamine D3 receptor. For the development of novel ligands with high affinity and selectivity for dopamine D3 receptors, investigation in refined structure-affinity relationships (SAR) of analogues of the lead BP 897 has been performed. Replacement of the naphthalen-2-carboxamide of BP 897 by aryl amide residues (1 - 4) had a clear influence on affinity binding and selectivity for dopamine D3 receptors. Introduction of the benzo[b]thiophen-2-carboxamide (1) has markedly improved binding with subnanomolar affinity and enhanced selectivity for dopamine D3 receptors. Exchanging the aryl substituted basic alkanamine residue of 1 by a 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline moiety (6) emphasized the benefit of the 4-(2-methoxyphenyl) piperazine residue of BP 897 regarding dopamine D2 and D3 receptor affinities. The change of particular elements of BP 897 and the rearrangement of the amide functionality resulted in inverse amide compounds with new chemical properties. Moderate affinity binding data, as obtained for the isoindol-1-carbonyl compound 11, suggest that inverse amides provide a worthwhile new lead structure with a novel structural scaffold. A hybrid approach combining privileged scaffolds of histamine H1 receptor antagonists and fragments of dopamine D3 receptor-preferring ligands, related to BP 897and analogues has been investigated. Various benzhydrylpiperazine derivatives and related structures have shown moderate to high affinities for dopamine D3 receptors with the impressive enhancement of the cinnamide substituted bamipine-related hybrid 39, exhibiting the highest affinity and selectivity for dopamine D3 receptors. Improved affinity profiles of structural modified histamine H1 receptor antagonists for dopamine D2 and D3 receptors and a refined SAR has been achieved. A SAR of derivatives of the dopamine agonist pramipexole and the related etrabamine has been studied. The propargyl substituted etrabamine derivative 61 demonstrated highest affinity and selectivity. The ligand attracts attention since neuroprotective properties have been reported for the propargyl functionality. Further development resulted in the most promising compound 64, a cinnamide derivative with 4-fluoro substitution on the phenyl ring. Subnanomolar affinity and remarkable selectivity for dopamine D3 receptors has aroused particular interest in this ligand due to its development potential as a radioligand for PET studies. Radioligand binding studies in combination with virtual screening and different classification techniques of chemoinformatic methods resulted in further elucidation of SAR. New leads with novel chemical scaffolds have been found in the bicycle[2.2.1]heptane derivative 95 and the benzhydrylidene substituted pyrrolidindione 112 and can be further optimized by chemical modifications. The outcome of the studies provides the development of various novel high affine and dopamine D3 receptor selective ligands. Modifications of lead structures or application of chemoinformatic tools in combination with radioligand competition binding assays have resulted in new leads with different chemical scaffolds. Furthermore, a comprehensive insight into structure-affinity relationships of ligands at dopamine D3 receptors has been revealed. This refined SAR is valuable to develop more affine and selective drug candidates with a designed pharmacological receptor profile.
• Das Ziel der Arbeit war die Entwicklung von neuen Liganden zur Beeinflussung der Neurotransmission im zentralen Nervensystem. Der Fokus lag auf dem Dopamin-D3-Rezeptor, der eine wichtige Rolle bei Morbus Parkinson, Schizophrenie und Drogenmissbrauch spielt. Aufgrund seiner Strukturähnlichkeit zum Dopamin-D2-Rezeptor ist es eine Herausforderung, neue, selektive Leitstrukturen für den Dopamin-D3-Rezeptor zu identifizieren bzw. zu optimieren. Ein in vitro Testsystem ist hierfür erforderlich und ermöglicht das Aufstellen von Struktur-Wirkungsbeziehungen (SAR) und ein rationales Wirkstoffdesign. Die Arbeit umfasste die Etablierung von Radioliganden Bindungsassays an Dopamin-D2S- und -D3-Rezeptoren, sowie am verwandten aminergen Histamin-H1-Rezeptor, die stabil in Zelllinien von Ovarien des Chinesischen Hamsters exprimiert wurden. Sättigungsstudien wurden mit [³H]Spiperon am Dopamin-D2S- und D3-Rezeptor und mit [³H]Mepyramin am Histamin-H1-Rezeptor durchgeführt. Die ermittelten Dissoziationskonstanten (Kd) und maximale Zahl der Bindungsstellen (Bmax) stimmten mit den Literaturwerten überein. Die in Verdrängungsstudien bestimmten Inhibitionskonstanten (Ki) von Referenzsubstanzen am Dopamin-D2S- und -D3-Rezeptor sowie am Histamin-H1-Rezeptor bestätigten die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Bindungsassays. Zur Unterscheidung der Agonisten von Antagonisten wurden „GTP-Shift“ Assays am Dopamin-D2S- und -D3-Rezeptor angewandt. Für Pramipexol und das Selenanaloga 54 wurden zwei Bindungszustände mit unterschiedlichen Affinitäten (ein so genannter „high- und low affinity state“) am Dopamin-D2S-Rezeptor in Abwesenheit von Gpp(NH)p beobachtet. Eine Affinitätsabnahme („GTP-Shift“) in Anwesenheit von Gpp(NH)p zeigte sich für die Agonisten am Dopamin-D2S- und -D3-Rezeptor. Dieser Einfluss des Gpp(NH)p konnte nicht für den Antagonisten ST 198 und den partiellen Agonisten BP 897 gezeigt werden. Für diese Verbindung wurde ein inverser „GTP-Shift“, also eine Affinitätsverbesserung am Dopamin-D3-Rezeptor beobachtet. Um neue Liganden mit hoher Affinität und Selektivität für den Dopamin-D3-Rezeptor zu entwickeln, wurden ausführliche SAR verschiedener Derivate der Leitstruktur BP 897 und ST 198 erstellt. Der Austausch des Naphthalen-2-carboxamid-Rests von BP 897 durch verschiedene Arylamid-Strukturen (1 – 4) zeigte deren deutlichen Einfluss auf die Dopamin-D3-Rezeptorbindungsaffinität und -selektivität. Die Einführung eines Benzo[b]thiophen-2-carboxamid-Rests führte in Verbindung 1 zu herausragender subnanomolarer Affinität am Dopamin-D3-Rezeptor sowie zu deutlich erhöhter Selektivität im Vergleich zu BP 897. Die Variation des lipophilen basischen Amin-Restes von 1 ergab das 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-Derivat 6. Verdrängungsstudien konnten den Vorteil des 4-(2-Methoxyphenyl)piperazine-Substituenten von BP 897 bezüglich der Affinitäten am Dopamin-D2S- und -D3-Rezeptor deutlich zeigen. Modifikationen einzelner Elemente von BP 897 und ST 198 und die veränderte Integration der Amid-Funktion in dem lipophilen Aryl-Rest führten zur Substanzklasse der inversen Amide mit neuen chemischen Eigenschaften. Moderate Bindungsaffinitäten, wie für das Isoindol-1-carbonyl-Derivat 11 gezeigt, legen nahe, dass inverse Amide eine lohnenswerte neue Leitstruktur mit andersartigem strukturellem Gerüst darstellen. In einer Hybrid-Strategie wurden Strukturelemente von Histamin-H1-Rezeptorantagonisten mit Substrukturen von Liganden mit ausgeprägter Dopamin-D3-Rezeptorpräferenz kombiniert. Daraus resultierten Benzhydrylpiperazin-Derivative und verwandte Substanzen mit moderater bis hoher Affinität am Dopamin-D3-Rezeptor. Besonders hervorzuheben ist das Zimtsäureamid substituierte und zum Bamipin verwandte Hybrid 39, welches die besten Ergebnisse in dieser Serie hinsichtlich Affinität und Selektivität am Dopamin-D3-Rezeptor erbrachte. Verbesserte pharmakologische Profile der strukturell modifizierten Histamine-H1-Rezeptorantagonisten am Dopamin-D2S- und -D3-Rezeptor und eine differenzierte SAR wurden erreicht. Für Derivate des Dopaminrezeptoragonisten Pramipexol und des strukturähnlichen Etrabamin wurden SAR ausgearbeitet. Das Propargyl substituierte Etrabamin-Derivat 61 zeigte herausragende Dopamin-D3-Rezeptoraffinität und -selektivität. Der Ligand ist von Interesse, da für den Propargyl-Rest neuroprotektive Eigenschaften berichtet wurden. Die Weiterentwicklung führte zur Verbindung 64, einem Zimtsäureamid-Derivat mit 4-Fluor-Substitution am Phenylring. Subnanomolare Affinität und hohe Selektivität am Dopamin-D3-Rezeptor prädestinieren 64 zur Anwendung als potentiellen PET-Radioliganden. Radioliganden Bindungsstudien wurden auf die Ergebnisse von virtuellen Screeningstudien angewandt. Sie führten zur Identifizierung neuer Leitstrukturen und zum weiteren Verständnis der SAR. Als neue Leitstrukturen mit verschiedenartigen chemischen Gerüsten wurden unter anderem das Bicyclo[2.2.1]heptan-Derivat 95 und der Benzhydryliden substituierte Pyrrolidindion Ligand 112 gefunden. Diese können nun zur weiteren Optimierung chemisch modifiziert werden. Die in dieser Arbeit durchgeführten Radioliganden Bindungsstudien führten zur Identifizierung, Entwicklung und Optimierung von hoch affinen und selektiven Dopamin-D3-Rezeptor Liganden. Des Weiteren ermöglichten die Ergebnisse eine ausführliche Vertiefung der SAR. Die kombinierte Strategie von chemoinformatischen Methoden und Radioliganden Bindungsstudien hat das Finden neuer Leitstrukturen als potentielle Arzneistoffe erlaubt. Die Resultate ermöglichen in der Zukunft ein gezieltes Liganden-Design mit einem gerichteten pharmakologischen Rezeptorprofil.