Open Access

Chuansheng Zhang

• Metabotropic glutamate receptor subtype 7 (mGluR7) belongs to the family of G-protein coupled receptors. mGluR7 is widely distributed in the brain and primarily localized at presynaptic terminals, where it is thought to regulate neurotransmitter release and synaptic plasticity. Studies have shown that the intracellular C-terminal tail of mGluR7 binds a variety of proteins in addition to trimeric G-proteins. These newly identified protein interactions are believed to play a key role in the synaptic targeting and G-protein dependent signaling of mGluR7. Protein interacting with C kinase 1 (PICK1), a PDZ-domain protein, is a strong interaction partner of mGluR7a. In order to investigate the role of PICK1 in the synaptic trafficking and signaling of mGluR7a, a knock-in mouse line in which the interaction of mGluR7a and PICK1 is disrupted was generated. Analysis of the mutant mice by immunocytochemistry and immunoelectron microscopy showed that the synaptic targeting and clustering of mGluR7a was not altered, indicating that PICK1 is not required for mGluR7a receptor membrane trafficking and synaptic localization. However, when the spontaneous synaptic activity of cerebellar granule cell cultures prepared from both wild-type and knock-in mice was monitored, and L-AP4 (400μm) was found to decrease the frequency, but not the amplitude, of spontaneous excitatory currents in wild-type neurons, while no effect of L-AP4 on spontaneous synaptic activity was observed in knock-in neurons. This indicates that PICK1 binding to the C-terminal region of mGluR7a plays an essential role in mGluR7a mediated G-protein signaling. We examined the threshold sensitivity for the convulsant pentetrazole (PTZ) in knock-in mice. It was found that mGluR7a knock-in mice had a greater sensitivity to PTZ than wild-type mice. Moreover, the surface parietal cortex EEG recordings of the mutant mice revealed spontaneous synchronous oscillation, or "spike-and-wave discharges" (SWD), which displayed similar characteristics to absence-like seizures. It was also observed that the knock-in mice responded to pharmacology as human absence epilepsy. These data suggests that the knock-in mice displayed the phenotype of absencelike epilepsy. Furthermore, the behavioral analysis of the mGluR7a knock-in mice showed no deficits in motor coordination, pain sensation, anxiety as well as spatial learning and memory, thus the interaction of mGluR7a and PICK1 appears not to contribute to these physiological processes. Taken together, our data provides evidence for an important role of PICK1 in Gprotein dependent signaling of mGluR7a, whereas PICK1 is not required for synaptic targeting and clustering of mGluR7a. Our results also provide an animal model of absencelike epilepsy generated by disruption of a single mGluR7a-PDZ interaction, thus creating a novel therapeutic target against this neurological disease.
• Die Aminosäure Glutamat ist nicht nur ein Schlüsselmolekül im Stoffwechsel jeder Zelle, sondern sie fungiert auch als primärer exzitatorischer Neurotransmitter im zentralen Nervensystem von Säugetieren. Erregende Nervensignale, die durch Glutamat vermittelt werden, spielen bei vielen Prozessen im Gehirn eine Rolle, einschließlich kognitiver Leistungen wie zum Beispiel Lernen und Gedächtnisbildung. Glutamat bindet nach Sekretion in den synaptischen Spalt an Glutamat-Rezeptoren, wodurch eine Reihe von Signalkaskaden im nachgeschalteten Neuron aktiviert werden. Es werden zwei Klassen von Glutamat-Rezeptoren unterschieden: ionotrope Glutamatrezeptoren, zu denen die nach ihren jeweiligen Agonisten benannten NMDA-, AMPA- und Kainat-Rezeptoren zählen, und metabotrope Glutamat-Rezeptoren (mGluR). Bei letzteren handelt es sich um G-Protein gekoppelte Rezeptoren, welche über GTP-bindende Proteine die Aktivierung intrazellulärer Signalkaskaden vermitteln. Diesen Rezeptoren werden Aufgaben bei der Regulation verschiedener Formen neuronaler Plastizität zugeschrieben. Es sind gegenwärtig acht Subtypen bekannt (mGluR1-8), die anhand von Sequenzhomologien und pharmakologischen Eigenschaften in drei Gruppen (I-III) eingeteilt werden. Von besonderem Interesse für diese Doktorarbeit war die Untersuchung des zur Gruppe III zählenden, präsynaptisch lokalisierten Rezeptors mGluR7a. Es handelt sich dabei um einen sogenannten Autorezeptor, welcher nach Aktivierung durch Glutamat zu einer Verringerung der Transmitterfreisetzung in der Präsynapse führt. Die molekularen Mechanismen dieser Form von präsynaptischer Inhibition sind erst teilweise verstanden. Es wurde bereits gezeigt, daß die Reduktion der Transmitterausschüttung mit einer Hemmung spannungsabhängiger Kalzium-Kanäle in der Präsynapse einhergeht. Allerdings ist noch unklar, ob diese Effekte direkt durch G-Proteine vermittelt werden oder weitere Signalmoleküle involviert sind. Zur Analyse der funktionellen Regulation von mGluRs der Gruppe III wurde weltweit in verschiedenen Arbeitsgruppen gezielt nach Interaktionspartnern für die einzelnen Rezeptoren gesucht. Es konnten einige Proteine identifiziert werden, welche mit mGluR7a interagieren, wie z.B. die G-Protein-Untereinheit bg, Calmodulin, MacMARCKS, Filamin-A u.a. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit soll die Interaktion des PKC-bindenden Proteins PICK1 mit dem Rezeptor-CTerminus genauer untersucht werden. Das Protein PICK1 verfügt über eine PDZ Domäne, welche die Assoziation mit anderen Proteinen, auch die mit mGluR7a, mediiert. Weitere Motive sind zwei coiledcoil Motive, welche für die Dimerisierung von PICK1 verantwortlich sind; eine azide Glutamat-Aspartat-reiche Region (E/D Motiv), die möglicherweise in Interaktionen mit weiteren Proteinen eine Rolle spielt, welche die synaptische Lokalisation des Rezeptors regulieren; sowie eine BAR Domäne, die an Membranlipide binden kann. Vorangegangene Untersuchungen zur Interaktion von PICK1 mit mGluR7a legten die Vermutung nahe, dass PICK1 entweder eine entscheidende Rolle bei der gezielten Anhäufung von mGluR7a am Ort der Transmitterausschüttung spielt und/oder regulierend auf die PKC-vermittelte Signaltransduktion einwirkt. Jedoch konnte weder die eine noch für die andere Hypothese aufgrund des Fehlens geeigneter in vivo Modelle experimentell belegt werden. Vor diesem Hintergrund ist die Generation einer geeigneten Mausmutante, in welcher die Interaktion der Rezeptor-C-Terminus von mGluR7a mit PICK1 gestört ist, das vornehmliche Ziel dieser Doktorarbeit...