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Soma Sengupta

• RcsB is a central transcriptional regulator in enteric bacteria involved in exopolysaccharide (EPS) biosynthesis, in cell division, in the expression of osmoregulated genes, and regulates at least 20 other genes and operons. It is a member of a phosphorelay system and signal transfer is mediated by phosphorylation through the RcsC/YojN phosphorelay. RcsB proteins modified with the phosphorylation mimic BeF3- as shown by its conformational changes and DNA binding properties and resulted phosphorylated RcsB derivatives with sufficient stability. Both, the wild type RcsB protein and the mutant RcsBD11A could be modified with BeF3-. Non-phosphorylated RcsB has been shown to bind as a heterodimer with the coinducer RcsA at the conserved RcsAB box in Rcs regulated promoters. In this study, it has been shown that the modification of RcsB by BeF3 - (I) has a negative effect on its homodimerization, (II) abolishes the complex formation of RcsAB with the RcsAB box as shown by the EMSA and SPR technique. All the effects were found to be reversible by increasing the NaF concentration in the assays presumably leading to the formation of the inactive BeF4 2- salt. This hypothesis of RcsB being modified by BeF3- was also supported by other phosphodonors like ATP and acetyl phosphate, both of them showed the same negative effect on DNA binding by RcsAB heterodimer giving evidence that BeF3- could be used as a phosphorylation mimic. In addition, the phosphorylation mimic BeF3- was found to be a better phosphorylating agent than ATP and acetyl phosphate. This is the first evidence that phosphorylation of RcsB might have a negative effect on the activation of RcsAB regulated operons. Autophosphorylation of RcsB proves that it has the ability to take up phosphoryl groups and the mutant protein also become autophosphorylated with less efficiency or stability than the wild type protein. RcsB probably takes up phosphoryl groups through RcsC -> YojN -> RcsB phosphorelay pathway. To study the interaction among the proteins in this pathway, fluorescence spectroscopy, NMR spectroscopy, and an in vivo ß galactosidase assay were performed by using two domains of RcsC (T-RcsC and R-RcsC), HPt domain of the protein YojN, and RcsB. The interactions between R-RcsC/YojN-HPt and YojN-HPt/RcsB supports the proposed pathway of phosphorylating RcsB. RcsB might also be phosphorylated by YojN-HPt that is phosphorylated by other sensor kinase other than RcsC in a cross-talk mechanism. The phosphorylation of RcsB by YojN-HPt probably has the same negative effect on cps induction as obtained with BeF3 - effect on DNA binding by RcsAB heterodimer.
• Obwohl sich das Gebiet der Signaltranduktion meistens auf eukaryotische Systemen konzentriert, sind prokaryotische Signalketten ebenfalls sehr verbreitet. Sie repräsentieren nicht nur eine grundlegende Strategie für die intrazelluläre Informationsbearbeitung, sondern biete sich auch als mögliche Ziele für die Entwicklung von Antibiotika an. Das vorherrschende Signal System in Bakterien ist ein Phosphotransfer Mechanismus, der als „Zwei-Komponenten“ Signal System bezeichnet wird. Die Kernelemente solcher Systeme, eine Histidin Kinase (HK) und ein Response Regulator (RR) Protein, wurden durch viele biochemische und strukturelle Studien bereits näher beschrieben (Stock et al., 1995; Stock et al., 2000). Ein Beispiel ist das Zwei-Komponenten System EnvZ-OmpR, das die Osmoregulation in Escherichia coli kontrolliert. EnvZ ist hier die Histidin Kinase, während OmpR den Response Regulator darstellt. Das EnvZ Protein katalysiert seine Autophosphorylierung an einem konservierten Histidinrest, wodurch eine Phosphatverbindung mit hoher Energie produziert wird. Der weitere Phosphotransfer von dem Phospho-Histidin des EnvZ auf einen konservierten Aspartatrest in der Receiver-Domäne von OmpR bildet ebenfalls eine hochenergetische Acyl-Phosphat Verbindung. Das Ausmaß an phosphoryliertem RR Protein bestimmt nun die Stärke der Reizweiterleitung. Deutlich komplexer aufgebaut sind die selteneren multiplen His -> Asp -> H is -> Asp Phosphorelay Systeme. Ein Beispiel ist das Arc System von E. coli, das mit Hilfe des hybriden HK Proteins ArcB ein sauerstofffreies Redox-System reguliert. Neben einer Kinase Domäne besitzt ArcB zusätzlich eine Receiver Domäne (RV) mit einem konservierten Aspartatrest sowie eine Phosphotransfer Domäne (HPt) mit einem konservierten Histidinrest. Der Phosphatrest wird von der HK Domäne über die RV Domäne auf die HPt Domäne übertragen. Die phosphorylierte HPt Domäne überträgt anschließend die Phosphatgruppe auf das RR Protein ArcA. Das außergewöhnlichste Phosphorelay System in E. coli bildet das RcsC -> RcsB System. RcsC ist ein Transmembranprotein mit einer periplasmatischen N-terminalen Domäne, einer cytoplasmatischen HK Domäne sowie einer cytoplasmatischen C-terminalen RV Domäne. RcsC ist daher ähnlich zu ArcB eine sogenannte hybride Sensor Kinase. Im Gegensatz zu ArcB besitzt RcsC jedoch keine HPt Domäne. Die rcsC und rcsB Gene liegen benachbart auf den E. coli Chromosom und werden divergierend transkribiert (Brill et al., 1988). In der Nachbarschaft von rcsB wurde ein weiteres Gen, yojN, gefunden. Das YojN Protein besteht aus 890 Aminosäuren und zeigt Ähnlichkeiten zu RcsC, insbesondere in der HK Domäne. Allerdings fehlt der konservierte Histidinrest, der notwendig für eine Autophosphorylierung wäre. Es ist daher unklar, ob YojN tatsächlich eine HK Funktion besitzt. Ebenso fehlt bei YojN eine terminale RV Domäne wie bei RcsC. Anstelle dessen enthält YojN eine terminale HPt Domäne (Mizuno, 1997). YojN hat daher einen bisher einzigartigen Aufbau, der aus einer mutmaßlichen und möglicherweise defekten HK Domäne sowie aus einer typischen HPt Domäne besteht. Diese YojN HPt Domäne ist offensichtlich in das RcsC -> RcsB Phosphorelay System involviert. Der Phosphotransfer von der YojN HPt Domäne auf die RV Domäne von RcsB konnte bereits demonstriert werden (Takeda et al., 2001). RR Proteine erhalten normalerweise Phosphatgruppen von ihren spezifischen Histidin Kinasen. Sie können jedoch auch alternativ durch Substanzen mit geringem Molekulargewicht wie z.B. Acetylphosphat, Carbamoylphosphat oder Phosphoramidat autophosphoryliert werden. Mit Hilfe von Acetylphosphat wurden in vitro bereits zahlreiche verschiedene gereinigte RR Proteine phosphoryliert und ihre Aktivität dadurch beeinflusst (Lukat et al., 1992; McCleary and Stock, 1993). Allerdings hat die Instabilität der Acyl-Phosphat Verbindung in RV Domänen von RR Proteinen mit Halbwertszeiten von Sekunden bis zu wenigen Stunden bisher strukturelle und funktionelle Studien der phosphorylierten Derivate weitgehend verhindert. RR Proteine dephosphorylieren spontan mit variierenden Halbwertszeiten von Sekunden für Phospho-CheY bis zu Stunden für Phospho-Spo0F (Zapf et al., 1998). Die Verwendung von Beryllium oder Aluminium Fluorid als eine neue Klasse von Phosphat-Analoga wurde zunächst für G-Proteine berichtet. In letzter Zeit wird insbesondere BeF3- als Analog für eine Aspartyl-Phosphat-Gruppe in RV Domänen verwendet und es konnte bereits bei zahlreichen RR Proteinen erfolgreich angewandt werden (Yan et al., 1999). Die RV Domäne von RcsB beinhaltet drei konservierte Aspartatreste an den Aminosäure-Positionen 10, 11 und 56, die zusammen die Phosphorylierungsstelle des RcsB Proteins bilden. Der Aspartatrest an Position 56 ist die eigentliche Phosphorylierungsstelle, während die Reste an Position 10 und 11 unterstützende Funktion haben. Es wurde beobachtet, dass die Mutante RcsBD11A zu einer erhöhten Induktion der Exopolysaccharidsynthese unabhängig von dem Coaktivator RcsA führte. Dieses Verhalten war ähnlich zu einer D13K Mutation des Regulators CheY und beide Mutationen führen daher vermutlich zu vergleichbaren konformellen Änderungen in den beiden Proteinen, verbunden mit einem konstitutionellen Phänotyp. Beide Mutanten simulieren vermutlich die aktivierte Form der Regulatoren (Gupte et al., 1997). In dieser Arbeit wurden vorwiegend konformelle Effekte bzw. Auswirkungen auf die Aktivität von RcsB nach einer Modifizierung durch BeFx untersucht. Es wurde beobachtet, dass alle Effekte ein Optimum zwischen 1 mM und 5 mM NaF hatten. Ein weiterer Anstieg in der NaF Konzentration führte in der Regel zu einer kompletten Umkehr der beobachteten Effekte und die ursprüngliche Konformation oder Aktivität des RcsB Proteins wurde wieder hergestellt. Diese Reversibilität demonstriert eine spezifische dynamische Modifikation des RcsB Proteins und schließt unspezifische Salzeffekte weitgehend aus. Die exakte Struktur des aktivierenden Beryllium Fluorid Moleküls ist z. Z. noch unklar. Die wahrscheinlichsten Formen sind jedoch BeF3-, BeF2 (OH)- und vermutlich auch BeF2 (Antonny et al.,1992; Goldstein, 1964). Das Molekül BeF3- wird in situ aus BeCl2 und NaF gebildet (Goldstein, 1964). Je nach Überschuss an F- sind verschiedene Formen an BeFx in einer wässrigen Lösung vorherrschend. Die höher fluorierte inaktive Form BeF4 2- wird daher bei zunehmenden Fluorid Konzentrationen gebildet. Meine Ergebnisse stimmen vollständig mit diesen Befunden überein und belegen, dass geringer fluorinierte Formen von BeFx, z.B. BeF3-, für die Modifikation von RcsB verantwortlich sind. Konformelle Veränderung des modifizierten RcsB Proteins wurden versucht, mit einer Trypsin Kartierung festzustellen. Das BeCl2/NaF behandelte Protein wurde kompakter und Schnittstellen für Trypsin wurden offenbar weniger zugänglich. Überraschenderweise führte die Punktmutation in der Mutante bereits zu einer starken Änderung in der Proteinkonformation. Im Vergleich zu dem Wildtyp RcsB Protein wurde mit Trypsin ein deutlich verschiedenes Fragmentmuster erhalten. Durch BeF3- modifiziertes RcsB und die Mutante RcsBD11A stellen daher zwei verschiedene Konformere dar. Die D11A Substitution könnte die in vivo Phosphorylierung von RcsB entweder durch eine Modifizierung der Phosphorylierungstasche oder durch Eingriffe in eine effiziente Interaktion des RcsBD11A Proteins mit den spezifischen Sensorkinasen beeinflussen. Es ist allerdings unwahrscheinlich, dass RcsBD11A die Fähigkeit zur Phosphorylierung vollständig verloren hat. Das mutierte Protein kann ähnlich dem Wildtyp RcsB Protein mit BeF3- modifiziert werden und beide zeigen daraufhin auch ähnliche Effekte. Wir vermuten daher, dass RcsBD11A in vivo weiterhin durch das RcsC-YojN Phosphorelay System phosphoryliert wird. Allerdings könnte die Effizienz und die Stabilität der Phosphorylierung durch die Mutation verändert sein. Phosphorylierung ist der am weitesten verbreitete Mechanismus zur Modulierung von Enzymaktivität und zur Kontrolle der DNA-Bindungsaktivität von transkriptionellen Regulatoren. Bei RR Proteinen von klassischen Zwei-Komponenten- bzw. Phosphorelay-Systemen ist die Aspartat-Phosphorylierung normalerweise mit einem Übergang von einem inaktiven in einen aktiven Zustand verbunden. So ist z.B. die Ligandenbindung des Chemotaxis-Regulators CheY durch Phosphorylierung kontrolliert. Die DNA-Bindungsaktivität von phosphoryliertem OmpR Protein ist um das 10- bis 30fache erhöht (Ames et al., 1999). Am auffälligsten war der Effekt von BeF3- auf die DNA-Bindingsaktivität von RcsB. Das modifizierte RcsB verlor vollständig die Fähigkeit zur Bildung eines Heterodimers mit dem Coaktivator RcsA. Dieses Ergebnis kann als erster Beleg dafür interpretiert werden, dass nichtphosphoryliertes RcsB die aktive Form in der Regulation der bakteriellen Exopolysaccharid (EPS) Synthese bzw. in der Kontrolle von jedem anderen RcsAB Box abhängigem Promoter darstellt. Diese Annahme wird durch die Beobachtung unterstützt, dass eine D56E Mutation in RcsB ähnlich zu der D11A Mutation ebenfalls einen konstitutiven EPS positiven Phänotyp ergab (Gupte et al., 1997). Es wurde vermutet, dass die Mutante RcsBD56E nicht mehr phosphorylierbar ist. Während Phosphorylierung meistens die Konversion einer inaktiven Form in eine aktive Form bedeutet, ist dies jedoch bei weitem nicht immer der Fall. Bei der Osmoregulation in Hefen stellt die phosphorylierte Form des Regulators SSK1 die inaktive Form dar (Posas et al., 1998). Das RcsB Protein kann demzufolge ebenfalls in die Gruppe der durch Phosphorylierung deaktivierten Proteine eingeordnet werden. Die Substanzen ATP und Acetylphosphat wurden ebenfalls zur Phosphorylierung von RcsB verwendet. Die beobachteten Effekte waren vergleichbar zu denen mit BeF3- modifiziertem RcsB und belegten daher die Anwendung dieser Technik zur Simulierung von Phosphorylierungen. Im Vergleich zu BeF3- waren jedoch die Ergebnisse mit ATP und Acetylphosphat variabler und es waren weitaus höhere Konzentrationen erforderlich. Auch die Mutante RcsBD11A konnte durch ATP autophosphoryliert werden, jedoch war die Effizienz und die Stabilität deutlich geringer im Vergleich zum Wildtyp RcsB Protein. Über Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Proteinen des RcsC -> YojN -> RcsB Phosphorelay Systems ist bisher nichts bekannt. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben erste Hinweise auf eine Interaktion zwischen YojN-HPt und RcsB und zwischen RcsC-RV und RcsB. Die Überproduktion von YojN-HPt in E. coli führte zu einer deutlich verringerten Induktion der EPS Synthese. Dieses Ergebnis kann mit einer verstärkten Phosphorylierung von RcsB durch das YojN-HPt Protein in vivo erklärt werden. In einem HSQC-TROSY Experiment wurden Wechselwirkungen zwischen dem 15Nmarkierten YojN-HPt Protein und der unmarkiertem RcsC-RV Domäne untersucht. Zahlreiche Reste zeigten signifikante Veränderungen in ihren chemischen Verschiebungen. Diese Ergebnisse belegen eine spezifische Interaktion zwischen den beiden Proteinen und unterstützen die Vermutung eines Phosphotransfers von der RcsC-RV Domäne auf die YojN HPt Domäne im Verlaufe der Signaltransduktion (Takeda et al., 2001). Von RcsC wurden bisher positive und negative Effekte auf die EPS Biosynthese berichtet (Stout et al., 1990). Diese Beobachtungen stimmen mit der Annahme überein, dass RcsC sowohl Kinase- als auch Phosphatase-Funktionen besitzt. Bisher wurde davon ausgegangen, dass die Detektion eines externen Signals durch die Sensor Kinase RcsC zu einem Anstieg von phosphoryliertem RcsB und damit zu einem Anstieg der EPS Synthese führt. Das Fehlen externer aktivierender Signale würde dann aufgrund der Phosphatase Aktivität von RcsC zu einer Dephosphorylierung von RcsB und damit zu einer Reduktion der EPS Synthese führen. Einige Mutationen wie z.B. das rcsC137 Allel waren bekannt, die zu hohen EPS Mengen auch ohne externe Signale führten. Es wurde angenommen, dass die entsprechenden Mutanten einen Defekt in der RcsC Phosphatase Aktivität hatten (Brill et al., 1988). Diese Phosphatase Aktivität wird in der RV Domäne des RcsC Proteins vermutet (Clarke et al., 2002). Ein C-terminal deletiertes RcsC Protein ohne die RV Domäne konnte auch autophosphoryliert werden, im Gegensatz zu dem kompletten RcsC Protein (Takeda et al.,2001). Die Resultate dieser Arbeit lassen jedoch eher vermuten, dass die Phosphatase Aktivität der RcsC RV Domäne zur Aktivierung von RcsB in Bezug auf eine erhöhte EPS Synthese führt. Eine Phosphorylierung von RcsB, z.B. durch Überexpression der YojN-HPt Domäne, führt dagegen zur Dissoziation des RcsB-RcsA Heterodimers und dadurch zu einer Auflösung des RcsAB/DNA Komplexes. Die RNA Polymerase kann dadurch weniger effizient an Promotoren mit einer RcsAB Box binden und es kommt zu einer verringerten Expression von EPS relevanten Genen.