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Stephanie Dinkelaker

• The ABC protein ABCE1, also called HP68 or RNase L inhibitor (RLI), is one of the most conserved proteins in evolution. It is universally expressed in eukaryotes and archaea, where ABCE1 is essential for life. ABCE1 plays a crucial role in translation initiation and ribosome biogenesis, however, the molecular mechanism of ABCE1 remains unclear. In addition to two ABC ATPase domains, ABCE1 contains a unique N-terminal region with eight conserved cysteines predicted to coordinate iron-sulfur (Fe-S) clusters. To analyze the function of ABCE1, the hyperthermophilic crenarchaeote Sulfolobus solfataricus was chosen as a model system. S. solfataricus ABCE1 was overexpressed homologously in S. solfataricus and heterologously in E. coli. Noteworthy, for tagged-protein production in S. solfataricus a novel expression system based on a virus shuttle vector was established. This is the first example for a successful overexpression and purification of isolated full-length ABCE1. For the first time it was shown that ABCE1 indeed bears biochemical properties of an ABC protein even though it has unique features. Remarkably, the nucleotide binding domains (NBDs) of ABCE1 bound ATP and AMP, but were functionally non-equivalent in ATP hydrolysis. Mutations of conserved residues in the second NBD led to a hyperactive ATPase, which implies an intramolecular mechanism of dimer formation. Truncation of the Fe-S cluster domains did not influence ATPase activity. The Fe-S clusters of ABCE1 were analyzed by biophysical and biochemical methods. As presented in this study, ABCE1 harbors two essential diamagnetic [4Fe-4S]2+ clusters, one ferredoxin-like cluster formed by cysteines at position 4/5/6/7 and one unique ABCE1 cluster formed by cysteines at position 1/2/3/8. ABCE1 was found to be associated with RNA after purification from S. solfataricus and bound ribosomal RNA in vitro. In addition, ABCE1 showed homo-oligomerization and appeared to form a hexameric complex of ~440 kDa, which was RNase sensitive. Archaeal ABCE1 associated with ribosomes, however, the unique Fe-S clusters of ABCE1 were not required for this interaction. Although archaeal ABCE1 assembled with ribosomes and ribosomal RNA, ABCE1 proved not to be essential for translation in S. solfataricus and did not interact with archaeal initiation factors. Nevertheless, the ABCE1 gene is one of the few genes conserved between archaea and eukaryotes and fulfills a universal task, which needs further characterization.
• Das ABCE1-Protein ist eines der hochkonserviertesten Proteine in der Evolution. Orthologe ABCE1 Sequenzen kommen bis auf Bakterien in allen untersuchten Organismen vor. Dabei sind die ABCE1 Sequenzen von Archaeen und Eukaryoten zu mehr als 48% identisch. Unter den Eukaryoten ist die Identität sogar noch größer und liegt beispielsweise bei 68% im Vergleich zwischen der Bäckerhefe und dem Menschen. Da es sich hierbei um eine ungewöhnlich hohe Sequenzidentität handelt, ist es nahe liegend, dass ABCE1 eine Schlüsselrolle in der eukaryotischen und archaealen Zellphysiologie spielt. Verschiedene Studien in Eukaryoten haben gezeigt, dass ABCE1 essentiell für das Überleben der Zellen ist. Wenn die Expression von ABCE1 durch RNA-Interferenz stark herunterreguliert wird, kommt es zum Wachstumsstillstand oder zum Absterben des Organismus im embryonalen Zustand. Allerdings ist die genaue Funktion von ABCE1 bislang nicht bekannt. Zuerst wurde ABCE1 als RNase L Inhibitor beschrieben. Die RNase L ist ein Enzym, das zum körpereigenen Abwehrsystem gegenüber Viren gehört und durch Interferone aktiviert wird. ABCE1 verhindert hierbei die Bindung von 2’-5’-Oligoadenylat an die RNase L, welches zur Aktivierung von RNase L notwendig ist. Daneben zeigte sich, dass ABCE1 eine entscheidende Rolle bei der HIV-Infektion spielt. Die Kapside der HI-Viren können nur durch die Mithilfe des ABCE1-Proteins in der Zelle zusammengebaut werden, wobei ABCE1 ausschließlich an unvollständig assemblierte Virenhüllen bindet, nicht aber an gereifte Viruspartikel. Weiterhin wurde gezeigt, dass ABCE1 eine Funktion bei der Translationsinitiation und der Ribosomenbiogenese spielt. Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus von ABCE1 in diesen verschiedenen Prozessen ist jedoch weitgehend unbekannt. ... In dieser Arbeit wurde die Funktion von ABCE1 und der molekulare Mechanismus der einzelnen Domänen im archaealen, thermoacidophilen Organismus Sulfolobus solfataricus (S. solfataricus) als Modellsystem untersucht. Da die Funktion von ABCE1 in Archaeen bisher unbekannt ist, wurde in dieser Arbeit die Fragestellung adressiert, ob eine mögliche universelle Rolle von ABCE1 bei der Translation der Grund für die evolutionär hohe Konservierung ist. Dazu wurde ABCE1 aus S. solfataricus heterolog in Escherichia coli (E. coli) und homolog in S. solfataricus exprimiert. Für die homologe Expression von ABCE1 in S. solfataricus wurde ein neues Expressionssystem etabliert. Dabei ist ABCE1 eines der ersten Beispiele für rekombinante Proteinexpression in S. solfataricus. Während viele Systeme für die Expression von rekombinanten Proteinen in Bakterien und eukaryotischen Modellorganismen existieren, wurden bis jetzt nur sehr wenige Transformationssysteme in Archaeen entwickelt. Ein derartiges homologes Expressionssystem ist wahrscheinlich besonders für die Assemblierung der Fe-S-Cluster in ABCE1 bei hohen Temperaturen und in Gegenwart nativer Cofaktoren von großem Vorteil. Für die Expression in S. solfataricus wurde ein shuttle vector entwickelt, in dem die gesamte DNA des Sulfolobus shibatae-Virus 1 mit pUC18 für die Replikation und Selektion in E. coli kombiniert wurde. Dieser Vektor integriert an spezifischen Stellen in das Genom von S. solfataricus und enthält einen Arabinose-induzierbaren Promotor. Für die Expression von ABCE1-Mutanten wurde das genetisch leichter zugängliche Expressionssystem in E. coli genutzt. ABCE1 wurde über einen C-terminalen affinity tag (His8-tag oder StrepII-tag) im homologen Expressionssystem und einen C-terminalen His6-tag im heterologen Expressionssystem isoliert. In beiden Systemen wurde die Isolation optimiert, um möglichst reines ABCE1-Protein (95%) zu erhalten, dabei wurden 0,5-0,75 mg isoliertes ABCE1-Protein pro Liter Kultur erhalten. Dies ist die erste Studie, die auf Experimenten mit isoliertem full-length ABCE1-Protein basiert.