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Iris Graf

• I. Untersuchung der Transformationsmaschinerie in Acinetobacter baylyi ADP1 durch Analyse der subzellulären Lokalisation von Kompetenzproteinen, Mutantenstudien und In-vivo-Detektion des DNA-Translokators in der lebenden Zelle. 1. Durch Komplementationsstudien konnte gezeigt werden, dass die Markerinsertionen in den Mutanten T843 (comM::nptII) und T840 (comL::nptII) keine polaren Effekte auf stromabwärts gelegene Gene des comM-Q Clusters haben. Hieraus kann geschlossen werden, dass ComM und ComL essentiell sind für die natürliche Transformation. 2. Mit Hilfe der sacB-nptII Selektionskassette wurde eine markerlose und somit nichtpolare Mutation in comN erzeugt. Diese Mutante war nicht mehr transformierbar, woraus eindeutig geschlossen werden kann, dass ComN ebenfalls essentiell ist für die natürliche Transformation. 3. Western-Blot-Analysen subzellulärer Fraktionen von A. baylyi ergaben, dass die Kompetenzproteine ComL und ComN in der inneren Membran lokalisiert sind. 4. Mutantenstudien führten zu dem Schluss, dass ComL in der comM-, der comN- und der comO-Mutante weder im Rohextrakt, noch in subzellulären Membranfraktionen nachzuweisen ist. Auch ComN ist in der comM- und der comO-Mutante weder im Rohextrakt, noch in subzellulären Membranfraktionen nachzuweisen. Daraus lässt sich folgern, dass die Proteine entweder die Expression der entsprechende Gene beeinflussen oder dass durch Interaktionen von ComM, ComN, ComL und ComO die Stabilität der Proteine erhöht wird. 5. Die Kompetenzproteine ComEA und ComP wurden translational mit GFPuv fusioniert (C-terminale Fusion). Die Expression der Gene comEA-gfp und comP-gfp, die auf dem Plasmid pRK415 unter der Kontrolle eines lac-Promotors vorlagen, führte nach Induktion mit IPTG zur Detektion der Fusionsproteine in A. baylyi. Über Komplementationsstudien konnte nachgewiesen werden, dass die ComEA-GFP- und ComP-GFP-Fusionsproteine funktionsfähig sind. 6. Fluoreszenzmikroskopische Analysen zeigten, dass die Verteilung von ComEA und ComP in der Zellmembran von A. baylyi abhängig ist von der Wachstumsphase und der Kompetenz: Während die Kompetenzproteine in der lag-Phase (zum Zeitpunkt maximaler Kompetenzinduktion) gleichmäßig über die gesamte Membran verteilt sind, finden sie sich im Laufe der exponentiellen Phase (mit abnehmender Kompetenz) in einer abnehmenden Zahl von separaten Foci, bis sie schließlich in der späten stationären Phase (zum Zeitpunkt minimaler Kompetenz) nur noch in 1 - 2 distinkten Foci lokalisiert sind. II. DNA-Transfer in marinen Bakterien 1. Vor der Auswahl geeigneter Selektionsmarker für DNA-Transferstudien in marinen Bakterien wurde eine Analyse der spontanen Resistenzen mariner Bakterien durchgeführt. Diese Analysen ergaben, dass 72 % von 116 marinen Isolaten sensitiv gegenüber einer Kombination von je 100 μg Kanamycin und 100 μg Streptomycin pro ml Medium sind. 2. Es wurde ein Transformationsprotokoll für das Screening mariner Bakterien auf die Fähigkeit zur DNA-Aufnahme durch natürliche Transformation etabliert. Es wurden drei Vektoren pM1, pM2 und pM3 konstruiert, die eine Übertragung und stabile Insertion von Antibiotikaresistenz-Markergenen und dem zur Detektion eingesetzten gfp-Gen durch homologe Rekombination flankierender rDNA-Bereiche mit dem rDNA-Operon des Rezipienten ermöglichten. 3. Unter Einsatz dieser Vektoren wurde die Transformierbarkeit von 83 marinen Isolaten überprüft. Diese Analysen führten zur Identifizierung von vier transformierbaren Isolaten. Bei diesen Isolaten handelt es sich um Marinobacter sp., K. rosea, P. phosphoreum und P. marincola Stämme.