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Tiago Ferreira de Barros

• The light-harvesting complex of photosystem II (LHC-II) is the major antenna complex in plant photosynthesis. It accounts for roughly 30% of the total protein in plant chloroplasts, which makes it arguably the most abundant membrane protein on Earth, and binds about half of plant chlorophyll (Chl). The complex assembles as a trimer in the thylakoid membrane and binds a total of 54 pigment molecules, including 24 Chl a, 18 Chl b, 6 lutein (Lut), 3 neoxanthin (Neo) and 3 violaxanthin (Vio). LHC-II has five key roles in plant photosynthesis. It: (1) harvests sunlight and transmits excitation energy to the reaction centres of photosystems II and I, (2) regulates the amount of excitation energy reaching each of the two photosystems, (3) has a structural role in the architecture of the photosynthetic supercomplexes, (4) contributes to the tight appression of thylakoid membranes in chloroplast grana, and (5) protects the photosynthetic apparatus from photo damage by non photochemical quenching (NPQ). A major fraction of NPQ is accounted for its energy-dependent component qE. Despite being critical for plant survival and having been studied for decades, the exact details of how excess absorbed light energy is dissipated under qE conditions remain enigmatic. Today it is accepted that qE is regulated by the magnitude of the pH gradient (ΔpH) across the thylakoid membrane. It is also well documented that the drop in pH in the thylakoid lumen during high-light conditions activates the enzyme violaxanthin de-epoxidase (VDE), which converts the carotenoid Vio into zeaxanthin (Zea) as part of the xanthophyll cycle. Additionally, studies with Arabidopsis mutants revealed that the photosystem II subunit PsbS is necessary for qE. How these physiological responses switch LHC-II from the active, energy transmitting to the quenched, energy-dissipating state, in which the solar energy is not transmitted to the photosystems but instead dissipated as heat, remains unclear and is the subject of this thesis. From the results obtained during this doctoral work, five main conclusions can be drawn concerning the mechanism of qE: 1. Substitution of Vio by Zea in LHC-II is not sufficient for efficient dissipation of excess excitation energy. 2. Aggregation quenching of LHC-II does not require Vio, Neo nor a specific Chl pair. 3. With one exception, the pigment structure in LHC-II is rigid. 4. The two X-ray structures of LHC-II show the same energy transmitting state of the complex. 5. Crystalline LHC-II resembles the complex in the thylakoid membrane. Models of the aggregation quenching mechanism in vitro and the qE mechanism in vivo are presented as a corollary of this doctoral work. LHC-II aggregation quenching in vitro is attributed to the formation of energy sinks on the periphery of LHC-II through random interaction with other trimers, free pigments or impurities. A similar but unrelated process is proposed to occur in the thylakoid membrane, by which excess excitation energy is dissipated upon specific interaction between LHC-II and a PsbS monomer carrying Zea. At the end of this thesis, an innovative experimental model for the analysis of all key aspects of qE is proposed in order to finally solve the qE enigma, one of the last unresolved problems in photosynthesis research.
• Der Lichtsammelkomplex des Photosystems II (light-harvesting complex II, LHC-II) stellt den Hauptantennenkomplex in der pflanzlichen Photosynthese dar. LHC-II fallen fünf Schlüsselrollen in der pflanzlichen Photosynthese zu: (1) Sammeln von Sonnenlicht und Weiterleitung der Anregungsenergie an die Reaktionszentren der Photosysteme I und II, (2) Regulierung der Menge an Anregungsenergie, welche beide Photosysteme erreicht, (3) Stabilisierung der Architektur der photosynthetischen Superkomplexe, (4) Beitrag zur dichten Packung der Grana-Thylakoidstapel in Chloroplasten und (5) Schutz des Photosyntheseapparates vor Lichtschäden durch die nicht-photochemische Löschung der Anregungsenergie (non photochemical quenching, NPQ). Einen großen Anteil am NPQ besitzt die energieabhängige Komponente qE. Obwohl ihre Notwendigkeit für das Überleben der Pflanze bekannt ist und die zugrunde liegenden Prozesse jahrzehntelang erforscht wurden, sind die exakten Mechanismen des Abführens von absorbierter Lichtenergie unter qE-Bedingungen weitgehend unbekannt. Es gilt als gesichert, dass qE durch den pH-Gradienten über die Thylakoidmembran reguliert wird. Weiterhin ist bekannt, dass infolge des pH-Abfalls im Thylakoidlumen unter Starklichtbedingungen das Enzym Violaxanthin-De-epoxidase (VDE) aktiviert wird, welches im Xanthophyllzyklus das Carotinoid Vio in Zeaxanthin (Zea) umwandelt. Desweiteren zeigten Studien an Arabidopsis Mutanten, dass PsbS, eine Untereinheit des Photosystems II, essentiell für qE ist. Inwiefern diese physiologischen Prozesse jedoch dazu beitragen, dass LHC-II von einem aktiven, Energie transferierenden, in einen Energie abführenden Zustand versetzt wird, in welchem Sonnenenergie nicht an die Photosysteme weitergeleitet, sondern in Wärme umgewandelt wird, ist ungeklärt und Gegenstand dieser Arbeit. Aus den Ergebnissen, die im Laufe dieser Doktorarbeit erhalten wurden, lassen sich fünf wesentliche Schlussfolgerungen in Bezug auf qE ableiten: 1. Der Austausch von Vio gegen Zea in LHC-II ist für ein effizientes Abführen von überschüssiger Anregungsenergie nicht ausreichend. 2. Energielöschung infolge von LHC-II Aggregation benötigt weder Vio und Neo, noch ein spezielles Chl-Paar. 3. Mit einer Ausnahme ist die Pigmentstruktur in LHC-II starr. 4. Beide Röntgenstrukturen von LHC-II zeigen denselben Energie abführenden Zustand des Komplexes. 5. Kristalliner LHC-II ähnelt dem Komplex in der Thylakoidmembran. Als Korollar aus dieser Doktorarbeit folgen Erklärungsmodelle sowohl für die Aggregations-verursachte Energielöschung in vitro, als auch für den qE-Mechanismus in vivo. Die infolge der Aggregation von LHC-II in vitro beobachtete Energielöschung wird der Bildung von Energiesenken in der Peripherie von LHC-II zugeschrieben, welche durch Interaktion mit anderen Trimeren, freien Pigmenten oder Unreinheiten hervorgerufen werden. Ein ähnlicher, jedoch nicht verwandter, Prozess wird für die Abführung überschüssiger Anregungsenergie in der Thylakoidmembran vorgeschlagen. Dieser beruht auf der spezifischen Interaktion zwischen LHC-II und einem PsbS-Monomer, welches Zea bindet.