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Birgit Jasmin Schneider

• Zusammenfassung Die Alzheimersche Krankheit (AD) ist mit 60% die am häufigsten auftretende Art der Demenz. Weltweit sind ca. 24 Mio. Menschen von der neurodegenerativen Krankheit betroffen, welche sich durch den Verlust der kognitiven Fähigkeiten auszeichnet. Es gibt zwei Ausprägungen der Demenz, zum einen die sporadische Verlaufsform, die bei Menschen in einem Alter ab 65 Jahren auftritt und zum anderen die familiäre Alzheimersche Krankheit (FAD), die schon weitaus jüngere Menschen betrifft und auf genetische Mutationen zurück zu führen ist. Beide Formen der Demenz zeigen den gleichen neuropathologische Phänotyp, der zur Ausbildung von extrazellulären Plaques und intrazellulären Neurofibrillen führt. Durch die Entstehung der Plaques und der Neurofibrillen werden die Verbindungen zwischen den einzelnen Neuronen verringert und die Neuronen sterben ab. Für das Auftreten der FAD sind Mutationen in den Genen des Amyloid Vorläufer Proteins (APP, Substrat) sowie der Aspartatprotease Einheit des γ-Sekretase Komplexes, Presenilin 1 (PS1) oder Presenilin 2 (PS2), verantwortlich. Die γ-Sekretase ist ein membranständiger Komplex bestehend aus den vier Untereinheiten PS1 oder PS2, Nicastrin (Nct), Aph-1 und Pen-2. Um ausreichende Informationen über den γ-Sekretase Komplex bezüglich seiner Interaktionsflächen, seines Katalysemechanismus und seiner Substraterkennung zu erhalten, wäre es hilfreich seine 3 Dimensionale Struktur aufzuklären, wozu große Mengen der sauberen und homogenen Proteine benötigt werden. Die Herstellung von ausreichenden Proteinmengen stellt derzeit aber einen Engpass für die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des γ-Sekretase Komplexes in-vitro dar. Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia, which affects 24 million people worldwide. It is a neurodegenerative disorder, which occurs either in its most common form in people over 65 years or in the rare early-onset familial AD (FAD). Responsible for the autosomal dominant FAD are mutations in the genes encoding for the β-amyloid precursor protein (APP) and the two homologues integral membrane proteins Presenilin 1 (PS1) and Presenilin 2 (PS2). The two PSs are major but alternative components of the intramembrane aspartyl protease γ-secretase. Further components are the membrane proteins Nicastrin (Nct), Aph-1 and Pen-2. Production of sufficient amounts of protein samples is still the major bottleneck for the detailed functional and structural in-vitro characterization of the γ-secretase complex. Due to toxicity, stability and targeting problems, the overproduction of MPs in conventional in-vivo systems often has only limited success. Therefore, efficient expression protocols using the cell-free (CF) system were established in this work. After optimization, I was able to produce up to milligram amounts of the single proteins PS1 and PS2, the cleavage products PS1-NTF and PS1-CTF, and Pen-2. The in-vitro produced γ-secretase subunits were further characterized, concerning their purity, secondary fold, thermal stability and homogeneity. Highest purities with over 90% after affinity chromatography could be achieved for PS1-CTF and Pen-2. Reconstitution of PS1, PS1-NTF, PS1-CTF and Pen-2 into E. coli liposomes results in a homogeneously distribution, which gives evidence for a structural folding. This was confirmed by CD spectroscopy of PS1-CTF and Pen-2. The thermal stability of Pen-2 shows a transition at 68°C, whereas PS1-CTF is stable up to 95°C. Both proteins show in addition homogeneous elution profiles investigated by analytical SEC and exhibit a monomeric (Pen-2) or dimeric (PS1-CTF) character analyzed by blue native PAGE. Different methods were performed to get evidence about the assembly of the complex, like pull-down experiments, immunoprecipitation, co-expression of radioactive labeled subunits and titration assays by liquid-state NMR. First hints for an interaction of the CF synthesized proteins could be observed by co-expression. Supplemental, Pen-2 and CTF could be purified in sufficient amounts and to apparent homogeneity that allow structural approaches by X-ray crystallography and liquid-state NMR spectroscopy. First conditions for protein crystals were achieved for Pen-2 and structural investigations of PS1-CTF by liquid-state NMR could be performed after optimization of the expression-, purification- and detergent conditions.
• In dieser Arbeit war es möglich, mithilfe der zellfreien Proteinsynthese die Ausbeuten an einzelnen γ-Sekretase Untereinheiten zu erhöhen, um funktionelle und strukturelle Untersuchungen durch zu führen. Zunächst wurden effiziente Expressions-Protokolle zur Herstellung der Proteine PS1, PS2, Pen-2, sowie den Spaltungsfragmente PS1-NTF und PS1-CTF, entwickelt. Hierbei konnten Milligramm Mengen der stabilen Membran Proteine (MPs) hergestellt werden. Für die lösliche Produktion der MPs wurden Detergentien aus der Familie der Polyoxyethylen-Alkyl-Ether als geeignet gefunden. Für die Resolubilisierung der Protein Präzipitate sind die Detergenzien 1-myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerol)] (LMPG) und Fos-ß-choline® 12 (DPC) am effektivsten. Nach den entsprechenden Optimierungsschritten konnten Ausbeuten von 0,3 mg/ml im Fall von PS1, PS2 und PS1-NTF, 0,7 mg/ml für Pen-2 und bis zu 1 mg/ml bei PS1-CTF erreicht werden. Die in-vitro synthetisierten Untereinheiten des γ-Sekretase Komplexes wurden mittels Affinitätschromatographie gereinigt und danach auf ihre Faltung, thermischen Stabilität und Homogenität hin untersucht. Nach der Optimierung der Reinigungsbedingungen konnte eine Reinheit von über 90% mittels Affinitätschromatographie für die Proteine PS1-CTF und Pen-2 erreicht werden, wohingegen für die Proteine PS1 und PS1-NTF ein Reinheitsgrad von 55% bzw. 75% erzielt wurde. Um die Qualität der Zellfrei synthetisierten γ-Sekretase Untereinheiten zu untersuchen, wurden verschiedenen Techniken verwendet. Die Homogenität der MPs wurde in verschiedenen Detergenzien mithilfe von analytischer Gelfiltration untersucht. Pen-2 weist in dem Detergenz Brij78 eine sehr hohe Homogenität auf, welche ausreichend ist für strukturelle Untersuchungen mittels Röntgenstrukturanalyse. Um Informationen über die Faltung der vier Untereinheiten PS1, PS1-NTF, PS1-CTF und Pen-2 zu erhalten, wurde die Fähigkeit der Proteine zur Rekonstitution in polare E. coli Liposomen untersucht. Hierbei konnte eine erfolgreiche Inkorporation in Verbindung mit einer gleichmäßigen Verteilung der MPs in Liposomen für jedes der vier Proteine erzielt werden. Dies deutet auf eine strukturelle Faltung der inkorporierten zellfrei Synthetisierten γ-Sekretase Proteine hin. Zusätzlich wurde eine α-helikale Sekundärstruktur für die gereinigten und löslichen Proteine PS1-CTF und Pen-2 in Detergenz mittels fern-UV CD-Spektroskopie ermittelt. Des Weiteren wurden die beiden Proteine PS1-CTF und Pen-2 bezüglich ihrer thermischen Stabilität mittels fern-UV CD-Spektroskopie untersucht. PS1-CTF zeigt eine hohe thermische Stabilität von über 95°C, wohingegen Pen-2 einen Übergangszustand zwischen gefaltetem und ungefaltetem Protein bei 68°C aufweist. Um Aufschluss über die Ausbildung von Monomeren oder Dimeren zu bekommen, wurden die beiden Proteine PS1-CTF und Pen-2 mittels blau nativer PAGE charakterisiert. Hierbei konnte ein Gleichgewicht zwischen Monomer und Dimer für PS1-CTF und eine Monomer Ausbildung von Pen-2 festgestellt werden. Um Aussagen über die Funktionalität und den Aufbau des γ-Sekretase Komplexes der in-vitro hergestellten γ-Sekretase Untereinheiten zu treffen, wurden Interaktions-Studien, mittels Pull-down Analysen, Immunoprezipitation und Co-Expression von Radioaktive markierten Untereinheiten durchgeführt. Erste Hinweise auf mögliche Interaktionen der in-vitro synthetisierten γ-Sekretase Untereinheiten liefert die Co-Expression von Radioaktiv markierten Untereinheiten. In der vorliegenden Arbeit konnten erste strukturelle Untersuchungen für zwei individuelle Untereinheiten der γ-Sekretase durchgeführt werden. Die beiden Untereinheiten PS1-CTF und Pen-2 konnten in großer Menge und Homogenität gereinigt werden, sodass strukturelle Analysen mittels Röntgenstrukturanalyse und flüssig NMR Spektroskopie durchgeführt werden konnten. Dabei konnten für Pen-2 erste Puffer Bedingungen für Proteinkristalle ermittelt werden.